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常见问题答疑

 

1.微生物组测序是否需要设置生物学重复,生物学重复的意义是什么,一般设置多少个?

为了实验设计的严谨、分析结果可靠、投稿顺利,微生物组测序需要设置生物学重复。
生物学重复能够能可以测量变异程度,够消除组内误差;降低背景差异,增强结果的可靠性;检测离群样本,异常样本的存在,会严重影响测序结果的准确性,通过计算样本间的相关性可以发现异常样本,将其排除。
自然环境至少3个生物学重复,一般推荐5个;若是人类的肠道、粪便等样品,由于个体特异性高,建议10个以上的重复。

2.微生物多样性测序与宏基组测序样品准备及样品邮寄注意事项

微生物多样性测序与宏基因组测序均需准备DNA样品。
微生物多样性DNA送样要求:
DNA样品总量:单次建库的量m≥0.25μg,建议送2次建库的量,即m≥0.5μg;
DNA样品浓度:c>5ng/μl,以Qubit质检结果为准;
DNA样品纯度:OD260/280在1.8~2.0之间;
DNA样品完整性:DNA无降解,即电泳有明显的主条带。
宏基因组DNA送样要求:
DNA样品总量:单次建库的量m≥2.5μg,建议送2次建库的量,即m≥5μg;
DNA样品浓度:c>100ng/μl,以Qubit质检结果为准;
DNA样品纯度:OD260/280在1.8~2.0之间;
DNA样品完整性:DNA无降解,即电泳有明显的主条带。
样品邮寄时,应使用干冰或冰袋运送DNA样品,保证DNA样品的完整性。

3.16S测序如何选择合适的测序区域?

调查文献发现16S测序会选择单V区(V4区)、双V区(V3-V4区或V4-V5区)以及三V区(V1-V3区、V4-V6区),但是并没有定论说测哪个区域更好。锐翌基因选择V3-V4区进行测序,原因有几下几点:引物序列设计覆盖率高;目标区域中已知物种种类较多;目标区域中物种测定准确率高;测序仪器读长限制。

4.宏基因组测序时,如何去除宿主污染?

取样时,尽量避免取到宿主部位;
DNA提取时,尽量去除杂质;
数据分析时,进行宿主数据库的比对,去除宿主污染的序列信息。

5.什么是Q20和Q30?

Q20是指一个碱基识别的可靠性等于99%,或者说出错可能性是1%;Q20数据量是指碱基质量高于20的个数占该条read中碱基总个数的百分比;
Q30是指一个碱基的识别可靠性等于99.9%,或者说出错可能性是0.1%;Q30数据量是指碱基质量高于30的个数占该条read中碱基总个数的百分比。
Q20与Q30是评价测序质量的指标。

6.什么是N50和N90?

将宏基因组denovo组装的序列按长度从大到小的顺序排序,依次累加序列的长度,当累加值第一次超过所有序列总长度的50%(90%)时,此时累加到的序列的长度值即为N50(N90)。相比序列平均长度,N50(N90)更能准确表示此次序列拼接的效果。

7.扩增子与宏基因组的区别?

扩增子测序指16S、18S、ITS测序,主要用于研究环境样品中微生物的组成,性价比高,实用性强;宏基因组主要用来研究环境样品中的微生物组成、基因组成、功能基因等信息,深度挖掘环境样品潜在的功能。

8.16S与宏基因组在微生物多样性分析的差异

数据库不同。16S使用的数据库是Sliva、Greengene或RDP数据库;宏基因组使用的是NCBI数据量;鉴定到不同水平上的物种的种类是不同的。16S在门、纲、目、科、属水平注释上的物种均多于宏基因组,而宏基因组仅在种水平注释上的物种组成显著多于16S。数据库不同。