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科研动态

【锐翌客户Paper】在猪粪堆肥过程中金霉素对多种抗生素抗性基因和微生物群落的影响
发布时间:2018-05-11 16:48   点击率:
2017年,锐翌基因协助哈尔滨工业大学在《Environmental Pollution》上发表研究成果《Effects of chlortetracycline on the fate of multi-antibiotic resistance genes and the microbial community during swine manure composting》。锐翌基因作为重要合作方,承担了16S rDNA的测序以及生物信息分析工作。


文献信息
标题:Effects of chlortetracycline on the fate of multi-antibiotic resistance genes and the microbial community during swine manure composting
译名:在猪粪堆肥过程中金霉素对多种抗生素抗性基因和微生物群落的影响
发表期刊:Environmental Pollution
发表时间:2017    影响因子:5.099
通讯作者:温沁雪
通讯单位:哈尔滨工业大学哈尔滨工业城市水资源与环境重点实验室
测序产品:16S V3-V4区
测序平台:Illumina HiSeq PE250


研究背景
金霉素(CTC)、磺胺甲基嘧啶(SMZ)、恩诺沙星(ENR)、红霉素(ERY)等抗生素已广泛应用于促进家禽生长,提高生产力或者控制动物疾病。然而,动物的不完全吸收导致70%的抗生素在粪便中排泄出来。粪肥堆肥是减少持久性有机污染物的重要措施,已有研究发现在实验室规模和试点规模的研究中,粪肥堆肥能够有效地降低抗生素的浓度。然而,在堆肥过程中,抗生素抗性基因(ARGs)的水平转移可能对环境造成潜在的风险。

本研究的目标是(1)调查在堆肥过程中多种抗生素的降解情况;(2)揭示ARGs的相对变化;(3)了解在多种抗生素条件下ARGs和微生物的作用关系。


材料与方法
研究对象
哺乳期母猪粪便样本。本研究包括一个对照组(未加CTC,即CK组)、两个实验组(CTC浓度分别为10 和20 mg/kg,即T1组和T2组),分别分析三组堆肥在90天内的粪便菌群变化以及ARGs的相对丰度变化。

测序策略
16S V3-V4 区, Illumina HiSeq PE250 ,测序分析工作由锐翌基因完成。


研究成果
1. 理化指标的分析
图1显示了在整个堆肥过程中温度、水分含量、pH、C/N的比例和萌发指数 (GI) 在三组样品中的变化情况。

理化指标测定结果显示,三个样本的温度在第五天达到高温阶段,在第十天时样品温度短暂下降后再次上升,在第35天时,所有样品的温度都下降到接近35℃。在接下里的5天内,T1和T2的样品的温度上升到40℃,CK样品在40℃持续了三天,41天以后,所有样品的温度下降(图1a)。

三个样品的初始水分含量为65%左右,堆肥后期在CK、T1和T2中的水分含量分别为50.03%、49.23%和48.33%(图1b)。

CK、T1和T2中的初始pH分别为8.49、8.50和8.45,在堆肥后期CK、T1和T2三个样品中的pH分别为7.79、7.61和7.68(图1c)。

三个样品中C/N的比例从一开始的18.8、20.93和19.40分别下降到14.8、17.60和13.56(图1d),GI指数从一开始的57%、45%和 40%升高到堆肥后期的90.57%、86.38%和81.74%(图1e)。

图1. 不同组理化指标测定

2. 堆肥过程中抗生素的变化
图2显示了在堆肥过程中四种不同种类抗生素的含量变化。

在堆肥过程中,SMZ和ERY的含量显著减少,在堆肥的第2天,它们就不能被检测到。

ENR在堆肥的1到8天降解,在第八天降解完全。

在CK、T1和T2中,CTC的初始浓度是分别是2.71 ± 0.03 mg/kg、10.61 ± 0.02 mg/kg 和22.52 ± 0.91 mg/kg,在前13天,CTC快速降解,并且在第13天时,CK、T1和T2样品中CTC的浓度分别为0.89 ± 0.045 mg/kg、1.87 ± 0.09 mg/kg 和6.81 ± 0.34 mg/kg。在本次研究中,CTC在CK和T1样品中被完全降解的时间为35天,然而,在T2样品中CTC被完全降解需要45天。

图2. 四种不同种类的抗生素在不同样品中的降解情况
a代表CK组,b代表T1组,c代表T2组

3. 堆肥过程中多重抗性基因的变化
图3显示了不同样品中抗性基因(ARGs)相对丰度的变化。

相对于T1和T2,在CK中金霉素抗性基因的相对丰度明显减少;在T2中金霉素抗性基因的相对丰度最高,并且在整个堆肥过程中金霉素抗性基因呈现下降趋势(图3a,c和e)。

磺胺类抗性基因比金霉素抗性基因的相对丰度少,在所有的磺胺类抗性基因中,sulI是相对丰度最高的。

大环内酯物抗性基因比磺胺类抗性基因和金霉素抗性基因要少,Erm是唯一的大环内酯物抗性基因,在堆肥过程中,磺胺类药抗性基因相对丰度减少。

四种喹诺酮类抗性基因gyrA、gyrB、parC和parE在整个堆肥过程中相对丰度减少(图3b,d和f)。

图3. 猪粪堆肥过程中不同样品ARGs相对丰度的变化
(a)CK中的金霉素抗性基因;(b)CK中的大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类药抗性基因;(c)T1中的金霉素抗性基因;(d)T1中的大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类药抗性基因,(e)T2中的金霉素抗性基因,(f)T2中的大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类药抗性基因。

4. 多重抗性基因之间的相互作用
图4用网络分析显示ARGs之间的皮尔逊相关系数。结果显示tetQ基因与ermF、tetX和ermF之间呈正相关,tetX基因也和ermF呈正相关。这个结果说明这些抗性基因可能有相同的宿主,或者一些细菌可以通过可移动的遗传元件来分享遗传信息。

图4. 网络分析显示ARGs之间的皮尔逊相关系数
节点的颜色表示不同种类的抗性基因。金霉素抗性基因(黄色)磺酰胺类抗性基因(橙色)大环内酯类抗性基因(蓝色)和喹诺酮类抗性基因(绿色)。浅绿色和红色的连接线表示显著相关并且P值分别在在0.01 < P < 0.05和0.001 < P < 0.01之间。

5. 在猪粪堆肥过程中细菌群落的变化
在整个堆肥过程中,厚壁菌门、放线菌门和杆菌门在三组中的含量比其它菌的含量高,在CK、T1和T2中,厚壁菌的含量分别从第一天的59.83%、59.19%和51.16%下降为第90天的56.21%、57.09%和21.04%。

拟杆菌门在CK、T1样品中的含量缓慢降低,而在T2中拟杆菌门的含量升高。

变形菌门在CK和T1的含量显著升高,分别从4.53%和 3.21%上升到第25天的56.74%和51.34%,之后显著下降到第90天的24.50%和 20.01%。然而,在T2样品中,变形菌门先从第一天的12.85%上升到第25天的40.39%,然后再升高到第90天的41.48%(图5a)。

甲烷短杆菌属是广古菌门的重要组成部分,并且含量比广古菌门中的其它属要高,在CK和T2中出现的甲烷杆菌从第一天的5.20%和17.22%迅速下降到了第90天的0.18%和 0.04%(图5b)。

图5. 在猪粪堆肥过程中细菌群落的变化
(a)细菌群落在门水平的变化;(b)微生物群落在属水平的变化

6. 主成分分析(PCA)
在所有的阶段中,CK和T1都与T2有显著的分离。轴1有42.91%的差异度,轴2有14.26%的差异度,说明CTC的浓度对微生物群落的组成有重要影响(图6)。

图6.PCA主成分分析显示了猪粪便堆肥过程中CT、T1和T2样品中微生物群落的变化。圆圈、方块和三角形代表分别来自于CK、T1和T2的样品。深蓝色的星星代表未处理的粪肥样品。不同的颜色表示表示粪便的收集时间,分别为第1、6、35、45和第90天。

7. 冗余分析(RDA)
图7结果显示在堆肥过程中,ARGs在CK、T1和T2三种样品中有很大的差异,并且在堆肥时的这种ARGs的差异和微生物群落有很大关系,从图中可以看出梭状芽胞杆菌属(Clostridium XI)芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)假单胞菌属(Pseudomonas)的含量变化与三种样品中ARGs的含量变化呈正相关并且在不同堆肥阶段细菌对ARGs的影响也是不同的。比如:拟杆菌门(拟杆菌属)在粪便堆肥的第1到5天内对于gyrB 基因的表达有促进作用,厚壁菌门(芽孢八叠球菌属)在高温阶段对tetX基因有促进作用,厚壁菌门(梭菌属和梭状芽胞杆菌)和变形菌门(假黄色单胞菌属)在冷却阶段对ARGs有促进作用。

图7.冗余分析(RDA)结果表示细菌属(红色箭头表示)和四种类型的ARGs(符号表示)之间的关系。变化百分比显示在坐标轴上。圆形,方块和三角形分别代表不同样本T2、CK和T1。不同的颜色表示表示粪便的收集时间,分别为第1、6、35、45和第90天。


研究结论
这项研究的结果表明,大多数金霉素、磺胺类药物、喹诺酮和大环内酯类抗性基因在猪粪堆肥过程中减少。然而,残留的抗生素并不是造成ARGs相对丰度变化的唯一原因。在堆肥过程中,微生物的群落变化是促使ARGs丰度变化的重要驱动力,在堆肥的中温阶段,厚壁菌门是ARGs的主要携带菌群,然而,在堆肥后期,变形细菌和放线菌门对ARGs的变化起着重要作用,这些结果对于堆肥过程中ARGs的削减控制及减少肥料中ARGs的传播有重要作用。


亮点
研究结果表明猪粪中大部分ARGs可通过堆肥有效地减少,从而证明了堆肥产品的安全性。



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