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科研动态

frontiers in Microbiology :DNA提取方法对评估奶牛瘤胃纤维和瘤胃液中微生物群落组成的影响
发布时间:2018-05-09 17:52   点击率:

导读

牛瘤胃是由细菌、古菌、原生动物和厌氧真菌组成的复杂的微生物生态系统,这些微生物通过相互作用以分解反刍动物饲料成分。研究瘤胃微生物多样性,对深入了解构成瘤胃生态系统的复杂微生物间的相互作用至关重要。研究表明,从瘤胃衍生的样品(瘤胃液RF和瘤胃纤维FC)中提取DNA的方法,显著影响着用不同分子技术(SSCP,DGGE,qPCR,NGS测序)观察到的微生物多样性。本研究主要评估四种在细胞裂解和DNA回收方法上有一定差异的DNA提取方法(RBB,PBB,FDSS,PQIAmini),比较四种提取方法对来自四种不同膳食喂养的奶牛瘤胃液样本(RF)和瘤胃纤维样本(FC)中微生物多样性的影响。
 
 
文献ID
题目: The Effect of DNA Extraction Methods on Observed Microbial Communities from Fibrous and Liquid Rumen Fractions of Dairy Cows
期刊:frontiers in Microbiology
年份:2018年1月      IF=4.076
作者:Jueeli D. Vaidya
单位:荷兰瓦格宁根食品与营养高级研究所
 
 
材料与方法
实验设计
1.不同膳食喂养的四头奶牛(GS100;GS67MS33;GS33MS67;MS100)
2.分别在瘤胃中取两种类型的样本:瘤胃液(RF)和瘤胃纤维(FC)
3. 四种不同的DNA提取方法提取同样的8个样本的基因组DNA:
(1)重复珠击法(RBB);(2)苯酚依赖珠击法(PBB);(3)提取土壤DNA的试剂盒(FDSS);(4)PQIAmini。
4.结果评价:(1)测定提取DNA浓度及吸光度(Nanodrop);(2)qPCR分别进行细菌、古菌和真菌的定量(BioRad CFX96);(3)焦磷酸测序评估细菌、古菌、真菌的群落组成。
5.测序区域及平台:细菌、古菌16s rDNA,真菌ITS1,测序平台454 Life Sciences GS-FLX平台。
 
测序区域及平台
细菌、古菌16s rDNA,真菌ITS1,
测序平台为454 Life Sciences GS-FLX平台。
 
 
研究成果
1、四种提取方法提取的基因组DNA的质量和数量
通过琼脂糖凝胶电泳,RF和FC样品均产生高分子量(> 3kb)的DNA。RBB方法观察到的DNA降解更少,而使用PBB能获得最高含量的DNA。DNA纯度评估发现,A260/280比率不受提取影响(p=0.08),但受样本类型影响(p =0.03)。另一方面,A260/230比率受提取方法影响(p <0.001),但不受样本类型影响(p = 0.8)。 
 
表1 四种膳食喂养的奶牛,两种类型样本用四种DNA提取方法提取的DNA浓度和纯度
 
 
2、细菌、古菌和厌氧菌的qPCR分析
qPCR数据的PCA揭示了PC1中FC和RF的单独聚类。沿着第一主成分轴(PC1),这两个聚类被厌氧真菌5.8S rRNA基因浓度分开。也有证据显示,第二主成分轴(PC2)中的提取方法是聚类的,RBB和FDSS方法集中在图的上半部分,PBB和PQIAmini集中在底部。古菌16S rRNA基因浓度与PC2中这两个簇的分离有关。
 
图1 RF和FC样品的细菌、古细菌和厌氧真菌qPCR数据的主成分分析
 
 
3、DNA提取方法和取样类型对细菌群落组成的影响
细菌类群的注释中只有26.3%包括属种级鉴定。因此,在数据分析中主要使用OTU(平均为56.2%的注释)。 基于加权UniFrac距离的PCoA在OTU水平显示,采用RBB、FDSS和PQIAmini方法的提取物中观察到的细菌群落通常分组在一起,而与采用PBB方法提取相关的细菌群落分别聚集。这在没有加权的基于UniFrac距离的PCoA中没有看到,但是,样品似乎更多地通过瘤胃取样类型聚集。
 
使用相对丰度数据进行冗余分析(RDA)表明,PBB(p = 0.012)和FDSS(p =0.024)DNA提取方法,与RDA1上的RBB和PQIAmini分开。 在RDA2上,样品被取样类型分开(p = 0.012)。 Ruminococcaceae似乎与PBB方法和FC正相关。 Fibrobacteraceae,未分类的Synergistetes和未分类的Bacteroidales这三个家族与FDSS方法和FC呈正相关。Prevotellaceae与FDSS方法和RF正相关。(注:RDA分析图:箭头代表不同的环境因子,射线越长表示该环境因子影响越大,环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系)。
 
图2 不同提取方法和瘤胃取样类型对细菌群落组成影响的冗余分析(RDA)
 
 
(1)细菌群落分析
RF和FC样品的更详细的组成分析显示,瘤胃细菌群落由15个门组成,其中Firmicutes(46.9±16.1%RF,39.7±15.7%FC)和Bacteroidetes(58.2±15.7%RF,26.9±11.2%FC)的相对丰度最高。总体而言,RF样品中的Prevotellaceae的相对丰度显著高于FC样品。对于Fibrobacteraceae,FC中的相对丰度更高(p=0.020),FDSS方法与PBB方法相比更高(p=0.028),RBB方法与PBB方法相比更高(p=0.038)。对于Ruminococcaceae,FC中的相对丰度更高(p=0.040),PBB方法相对FDSS更高(p=0.038)。在RF和FC样品中都存在的Lachnospiraceae,在FC样品中的相对丰度显着高于RF样品(p=0.006)。然而,DNA提取方法也对其没有影响。
 
相比之下,只有Fibrobacter被发现受到DNA提取方法的显著影响。与使用PBB方法提取的DNA相比,FDSS提取物中的Fibrobacter的相对丰度更高(p=0.038),并且RBB与PBB相比,提取物中的相对丰度也更高(p=0.038)。
 
图3 四种膳食喂养的奶牛,两种类型样本,四种DNA提取方法的物种丰度比较
 
 
 图4 不同提取方法和不同取样类型对几种细菌的相对丰度的影响
(注:黄色为RF样本,绿色为FC样本)
 
 
(2)细菌多样性和丰富度
接着,在OTU水平上计算细菌序列丰富度和多样性,以评估这些参数是否受取样类型或DNA提取方法的影响。来自GS67MS33和MS100饲喂奶牛的RF和FC的PBB方法提取物,通常具有通过Chao1指数计算的最低细菌丰度(群落中存在的OTU的总数),shannon指数也显示有类似的趋势。在GS100样品中,在RF样品中,Chao1指数通常表现出比FC样品更高的可变性。与FC样本相比,RF样本似乎具有较低的shannon指数值,而Chao1指数值并非总是如此。
 
图5 RF和FC样本的四种提取方法的Chao1指数(A)和Shannon指数(B)
(注:黄色为RF样本,绿色为FC样本)
 
 
(3)古菌群落分析
虽然事实上所有样品都在古细菌16S rRNA qPCR中成功扩增,但一些DNA提取物没有产生测序扩增子。此外,PCR失败也可能与样本类型,样本来源(牛/饮食)或任何DNA提取方法不直接相关。但是,FDSS方法在所有RF样本中一直失败。属于Euryarchaeota门的两个家族,即Methanobacteriaceae和Thermoplasmata-incertaesedis代表了大部分序列。 在Methanobacteriaceae中,检测到两个已知的属,即Methanobrevibacter(83%-98%)和Methanosphaera(1%-4%)。在可以产生序列信息的样品中,相对于不同的DNA提取方法发现,古菌属的相对丰度没有明显的差异。然而,与FC相比,从RF中看到的两个部分通常存在更多的Methanosphaera。
 
图6 四种膳食喂养的奶牛,两种类型样本,四种DNA提取方法的古菌丰度比较
(注:A图为RF样本,B图为FC样本)
 
 
(4)真菌群落分析
扩增后真菌ITS区域的焦磷酸测序分析揭示了RF和FC样品中存在几个真菌门,并且包括需氧真菌(Ascomycota和Basidiomycota)以及厌氧真菌(Neocallimastiomycota)。未确定的真菌类群(包括但不区分不明的厌氧菌和好氧菌)和未分配的真菌占优势。 可鉴定的厌氧真菌代表在RF样品中少于1%的读数。 另一方面,FC样品的特征为厌氧真菌的相对丰度更高,其由以下四个属代表:Cyllamyces(0-3.2%),Anaeromyces(0-5.2%),Neocallimastix(0-8.1%)和 Piromyces(0-31.5%)。由于厌氧真菌已知的数量有限且可变,因此不可能就该门对DNA提取方法进行深入分析。
 
表2 四种膳食喂养的奶牛,两种类型样本,四种DNA提取方法的真菌丰度比较
 
 
研究结论
DNA提取方法明显影响下游瘤胃微生物群落分析的结果,包括特定群落成员的相对丰度。从这项研究中,这种效应在细菌群落中是明显的,然而,没有单一的提取方法可以被认为是无效的。相反,每种提取方法在观察特定细菌家族时都表现出自己的优势和弱点。
 
DNA提取方法的效果与瘤胃取样类型的影响相比有限,但是对于某些分类群来说,由于DNA提取方法和取样类型都存在差异,需要进一步调查。此外,需要仔细选择微生物群落评估方法,以避免本研究在古细菌和厌氧真菌方面遇到的问题。总之,这里结果中观察到的细菌、古细菌和真菌群落的综合评估,为选择最佳方法获得瘤胃微生物代表群落提供了合理基础。
 

 亮点
1.选取了两种不同类型的牛瘤胃样本进行研究,取材较全面。
2.综合分析了细菌、古菌和真菌的群落组成,比单一分析细菌的群落组成更具说服力。
3.采用多种研究方法(qPCR、焦磷酸测序)综合分析,证明了四种DNA提取方法和取样类型对评估物种群落组成的影响,为进一步的研究奠定了基础。


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