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科研动态

Microbiome : 早产儿迟发性脓毒症和健康新生儿的肠道微生物组和代谢组的纵向发展
发布时间:2018-05-04 17:42   点击率:

导读

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征,迟发性脓毒症(LOS)在早产儿中有相当大的发病率和死亡率。虽然已有研究暗示肠道细菌在疾病的发病中发挥重要作用,但通常缺乏功能分析。本研究通过患有迟发性脓毒症的早产儿与健康早产儿的粪便代谢组学和16S rRNA测序微生物组学分析,深入了解了感染过程中微生物组和代谢组的相关变化,为脓毒症在诊断与治疗上提供了依据,并对儿童脓毒症的防治具有重要意义。
 
 
文献ID
题目: Longitudinal development of the gut microbiome and metabolome in preterm neonates with late onset sepsis and healthy controls
译名:早产儿迟发性脓毒症和健康新生儿的肠道微生物组和代谢组的纵向发展
期刊:Microbiome
年份:2017.12      IF= 8.496
通讯作者:Christopher J. Stewart
通讯单位:Baylor College of Medicine
 
 
材料与方法
实验设计
所有的早产婴儿都接受标准化的喂养(抗生素和抗真菌处理)。在检测用抗生素治疗至少5天的血液培养物为阳性,同时,两名临床医生独立评估结果均为脓毒症的情况下,LOS才被诊断确认。根据长期采集样本,从胎龄(相差小于1周),出生体重和分娩方式几个标准进行匹配,选取了7名LOS患者和28名健康对照(不含LOS或没有疾病), 总共613份粪便样本进行16S rRNA基因V4区 MiSeq 平台测序,分析菌群特征。对其中14名婴儿(63个粪便)通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定代谢组学特征,确定了4个LOS和10个匹配的健康对照。LOS样本选择了疾病诊断日前后5个时间点,-14天(时间点1; TP1),-7天(TP2),0天(确诊日,TP3),+7天(TP4)和+14天(TP5)进行分析,健康对照组也选择相对应的时间点。诊断性LOS血培养鉴定出2例金黄色葡萄球菌,2例表皮葡萄球菌,1例粪肠球菌,1例无乳链球菌和1例大肠埃希氏菌。
 
测序区域及平台
 16SrDNA, Illumina MiSeq平台 
 
研究成果
1、婴儿和样本信息
尽管如预期的那样,在LOS婴儿中抗生素使用更高,但LOS婴儿和对照婴儿的平均取样数相当,分别为15个和18个。
 
表1 每组婴儿样本统计的总结
*代表中位数(四分位间距)
 
2、LOS诊断前肠道微生物组中丰富的细菌属于LOS诊断后病原体的属
LOS婴儿肠道微生物组在整个时间内具有高度的个体性和动态性。由血培养鉴定的病原体是诊断时肠道微生物组中最丰富的OTU之一,其中来自肠道微生物组的相应属图1前四种情况中丰度最高,在图1后两种情况下是丰度第二的OTU。在婴儿251中的表皮葡萄球菌是例外,在LOS诊断时是第七丰富的属。 在所有情况下,诊断性血培养中分离的细菌属都存在于LOS诊断前。 对于被诊断患有无乳链球菌的婴儿173,在诊断前2天和抗生素治疗(氟氯西林和庆大霉素)后6天内检测到乳链球菌,其他时间没有检测到。
 
 
图1 面积图显示了诊断为迟发性脓毒症(LOS)婴儿的微生物组时间发展。 
红色虚线代表LOS诊断日,从血培养中分离出的细菌得到确定,黑虚线代表抗生素治疗的开始。
 
3、以双歧杆菌占主导地位的早产儿肠道菌群类型对LOS有保护作用
采用PAM聚类分析,进一步确定早产儿肠道微生物菌群类型(PGCTs)。所有样本被分成6个不连续的聚类(图S1):克雷伯氏菌主导型(PGCT 1),克雷伯菌和肠球菌主导型(PGCT 2),葡萄球菌主导型(PGCT 3),肠球菌主导型(PGCT 4) ,大肠杆菌主导型(PGCT 5)和混合群体以双歧杆菌占主导型(PGCT 6)(图S2)。与所有对照样本相比,在诊断前从未发现任何来自LOS婴儿样本属于PGCT 2和PGCT 6类型(图2a)。在诊断后,任何LOS婴儿也从未发现PGCT 6型,并且在诊断后仅有2名婴儿出现PGCT 2型(图2b)。相反,在对照组中从早期到晚期样本,都频繁出现了双歧杆菌相对丰度较高的PGCT6型。在来自12名对照婴儿的65个样品中检测到PGCT 6型,占对照群体的43%。婴儿生命前25天内独特PGCTs数量显示,对照组婴儿平均有3种独特的PGCTs,而Pre LOS样品中平均有2个PGCTs(P = 0.011)。
 
图2 诊断为迟发性败血症(LOS)的婴儿和对照组的肠道微生物组特征。
 A.转化网络分析显示,Pre LOS样本中的PGCTs型与对照组的马尔可夫链转化概率显示二者几乎没有相关性。
箭头代表从一个类型到下一个类型的转换概率, 圆的大小代表与该PGCT相关的样本数量,淡蓝色表示仅由对照样品组成的PGCT,紫色表示该PGCT在Pre LOS样本中数量增加。 B. 每个婴儿PGCTs的时间变化。 只包括截至生命第50天的样本,红线代表LOS诊断日,在研究期间,婴儿178死。
 
 
4、非靶向代谢组学分析表明LOS与对照婴儿之间具有不同的功能特征
尽管每个LOS婴儿在诊断性血培养中分离出不同的细菌种类(图1),但PCA显示LOS婴儿和对照婴儿之间的代谢物谱明显聚集,诊断时(0天)和+ 7天时差异最明显(图3)。 通过疾病检测模型ROC曲线分析,提供代谢物在LOS和对照之间区别程度的测量,AUC值是指ROC曲线的曲线下面积,代表预测分类的效果。线的走势越向左上角表示更好的区分效果(更高的敏感性和特异性)。诊断时,AUC值从5种代谢物的0.787到25种代谢物的0.883,两者相当于75%的灵敏度和89%的特异性。
 
图3 在5个时间点,LOS婴儿和对照婴儿之间的代谢组谱。
A. PCA分析,红色代表LOS婴儿,绿色代表对照婴儿。小圆圈和椭圆代表每种类型样本95%置信区间。B. 预测LOS和对照样本特性的诊断曲线(ROC)。从5,10,15,25,50和100代谢物中间隔计算代谢物的选定数量。
 
在诊断时(TP3),LOS和对照婴儿之间有14种粪便代谢物被鉴定为显著地改变,7种代谢物丰度在所有对照组显著高(表2)。半乳糖代谢是对照组婴儿增加最多的途径,蔗糖(P = 0.001)和棉子糖(P = 0.001)均来自半乳糖代谢,它们是最重要的代谢产物。这些代谢物在对照婴儿中随时间增加,而相同代谢物在LOS婴儿诊断前保持基线或降低(图4)。值得注意的是,在诊断和治疗之后,这些代谢物在LOS婴儿中增加,但与对照相比仍保持在较低强度下(除了来自C21-类固醇激素生物合成的代谢物在整个基线上保持不变)。综上所述,最重要代谢物的PCA和盒形图分析表明,在诊断之前,LOS婴儿肠道中的功能发育出现延迟等改变。
 
表2 在诊断时(0天)对照组和LOS婴儿之间代谢物和代谢途径显著改变的列表
 
 
图4 诊断为迟发性败血症(LOS)的婴儿和对照婴儿在每个时间点重要代谢物的盒形图。
按显著性列出:A. 蔗糖,B.棉子糖,C. L-谷氨酸,D.双甲基西酞普兰,E.乙酸,F. 18-羟基皮质醇,G.18-氧化皮质醇,H.L-α-乙酰-N-去甲二醇。
 
5、多元分析表明重要代谢物和丰富的细菌属之间存在显著相关性
使用MixO-mics进行sPLS相关分析以确定优势细菌属和代谢物之间的相关性(图5)。双歧杆菌和链球菌在对照婴儿中显着增加,并与一系列代谢物有显著的正相关性,包括棉子糖,18-羟皮质醇,18-氧皮质醇,乙酸和L-α-乙酰-N-去甲二醇(表2)。 摩根菌属也显示与这些代谢产物呈弱的正相关。韦荣球菌属呈现明显的聚集性,与一系列代谢物有很强的相关性,包括维生素K和抗坏血酸(维生素C)以及10,11-二氢-12R-羟基白三烯E4,这些代谢物在LOS婴儿中显著增加(P = 0.032)。葡萄球菌,拟杆菌属,埃希氏菌属,克雷伯菌属,肠球菌属和假单胞菌都与检测到的代谢物呈弱相关性。
 
图5 优势细菌属和代谢物之间的sPLS相关分析。以回归模式的sPLS来模拟细菌属和代谢物之间的因果关系.
绿框代表细菌属,红框代表在LOS中显着增加的代谢物,蓝框代表在对照中显着增加的代谢物,黄框代表在LOS和对照之间没有显着改变的代谢物。基于LOS诊断时婴儿肠道样品的代谢物丰度。
 
 
研究结论
1、诊断血培养中分离的细菌通常对应于肠道微生物组中的优势细菌属。
2、根据早产儿菌群类型(PGCTs)监测纵向变化,其中对照婴儿与LOS婴儿相比PGCT数量增加(P = 0.011)。
3、肠道菌群以双歧杆菌主导的PGCT 6型仅存在于对照婴儿中。
4、在诊断时和诊断后7天LOS和对照婴儿的代谢产物谱不同,但诊断前7天没有不同。
5、对照组中双歧杆菌与代谢物(包括棉子糖,蔗糖和乙酸)呈正相关。
6、综上所述,虽然代谢组学数据是初步的,但这些发现支持早产儿的肠道发育和保护与益生元寡糖(例如石蜡糖)增加和有益细菌(例如双歧杆菌)的生长相关。
 
 
亮点
婴儿样品选择严谨,取样周期长,样本量较大,代表性强。并通过代谢组和微生物组的综合分析,深入探讨感染婴儿的肠道菌群和代谢功能变化的相关性,为脓毒症的诊断与治疗提供科学依据。

 
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