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科研动态

Microbiome:通过化学方法去除宿主DNA以优化唾液的鸟枪法宏基因组测序
发布时间:2018-04-28 15:08   点击率:
导读
宏基因组测序方法以迅雷不及掩耳之势在微生物多样性分析、种群结构、进化关系等方面应用广泛,但在分析人体微生物时,由于人源基因组远远大于微生物基因组,即使在含有少量人源细胞的样本中宿主DNA依然可以很快地淹没微生物DNA,从而极大的影响微生物分析的精准性。基于此,本研究开发一种渗透裂解及叠氮碘化丙锭处理的新型化学方法(lyPMA)以去除宿主DNA,并证明了此方法在唾液菌群样本使用效果良好。
 
 
文献ID
题目: Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion
译名:通过化学方法去除宿主DNA以优化唾液的鸟枪法宏基因组测序
期刊:Microbiome        IF= 8.496
年份:2018年2月
通讯作者:Karsten Zengler
通讯单位:美国加州大学圣地亚哥分校儿科
 
 
材料与方法
实验设计
本研究比较分析了5种(分别为Fil(5-μm滤膜过滤)、NEB(1种试剂盒)、Mol(1种试剂盒)、QIA(1种试剂盒)、 lyPMA(渗透裂解细胞后用叠氮碘化丙锭处理))去除宿主DNA的方法, 并通过一系列实验表明lyPMA方法可有效去除宿主DNA。
 
lyPMA方法与一般的用DNAse去除宿主DNA的方法相似,该去除宿主DNA的方法分为两步:第一步选择性溶解人源细胞(原理:人源细胞比微生物细胞更脆弱),第二步代替酶消化用叠氮碘化丙锭去除宿主DNA(原理:PMA可选择性的修饰死细胞“暴露”的DNA)。相较于酶消化方法该方法便宜、操作简单,可大规模进行,且不要求新鲜样本。
 
测序区域及平台
宏基因组测序,Illumina HiSeq2500 
 
研究成果
1、基于宿主细胞与微生物细胞大小差异对宿主细胞进行清除
 
人源细胞与微生物细胞最明显的差异是细胞大小(粘膜上皮细胞平均大小为50μm,而一些典型的细菌细胞一般是1μm),因此尝试通过细胞大小来分离细胞(方法:样本通过5μm过滤器,然后将滤液、滤渣与原始样本进行比较评估;评估方法:qPCR检测 PTGER2基因含量,并与未经处理的样本进行比较),结果表明未经处理样本(raw)、滤液(fil)及滤渣(res)中PTGER2基因含量之间没有显著性差异(图1A);为了排除过滤过程中宿主细胞的剪切能力,用不同离心方式富集微生物DNA(方法:先用短时低速离心(30 s ,2500g)离出大细胞,然后长时快速离心(8min,10000g)收集上清液中剩余的细胞),与原始样品相比,离心各步骤中人源DNA含量并没有显著性差异(图1B);采用流式细胞分离术来分离微生物细胞与人源细胞,虽然可将细胞分成大中小三部分,然后各个部分中宿主DNA的含量没有显著性的差异(图1C、1D)。
 
 
图1 基于宿主细胞与微生物细胞大小差异对宿主细胞进行清除结果
 
以上结果表明,通过细胞大小来分离宿主细胞DNA并不成功,因此作者推测样本中存在大量的胞外DNA,而这些胞外DNA仅通过细胞大小分离是无法做到的。短时间低速离心去除大部分人源细胞后后用DNAse来处理样本显著性减少了宿主DNA含量(图1E),然而酶处理方法昂贵,敏感,且要求新鲜样本,而且难以大规模进行。
 
2、不同方法去除宿主DNA有效性评估
用宏基因组测序方法对8个健康人(每个样本3个平行)唾液样本进行测序,并将lyPMA方法与上述其他四种去宿主DNA方法进行比较, 测序得到的reads比对到人基因组,结果是:未处理样本宿主reads含量为(89.29 ± 0.61%),过滤(89.69 ± 0.84%)及NEB(90.83 ± 0.77%)与未处理样本宿主reads含量没有显著性差异,Mol (62.88 ±3.46%), QIA (29.17 ± 5.04),  lyPMA (8.53 ± 2.08%)三种处理方法与未处理样本宿主reads含量存在显著差异,而其中lyPMA处理方法宿主DNA含量最低。
 
Microbiome:通过化学方法去除宿主DNA以优化唾液的鸟枪法宏基因组测序
图2 唾液样本中宿主DNA含量
 
3、 消除宿主对微生物群落组成的影响
基于PCoA方法对每个样本而不是方法对微生物进行聚类(如图3a、b),表明样本间微生物群落差异在一定程度上受参与者生理差异的影响(图3a、3b)。不同个体同样去除宿主DNA的方法( BP-WM)的BrayCurtis差异显著高于同样的个体不同的去除宿主DNA方法(WP-BM)的差异(图3c),而同样的个体用同样的方法(WP-WM)样本之间的差异显著性低于上述两种技术重复性样本,表明宿主去除方法同样对微生物群落的组成存在一定的影响。

图3 基于样本而非去宿主DNA方法的PCoA
 
同时,该研究比较了去除宿主DNA的每一方法与原始样本的相似性(如图4),5种方法处理后的样本与原始样本之间的差异都显著地高于原始样本之间的差异(0.115 ± 0.009),但lyPMA (0.273 ± 0.011) 及Fil (0.226 ± 0.009)更相似于原始样本。
Microbiome:通过化学方法去除宿主DNA以优化唾液的鸟枪法宏基因组测序
图4 同一样本不同处理方法与未处理样本之间的差异
 
4 、评估lyPMA对冷冻唾液样品的处理效果
 
 
图5 冷冻样本处理方法(左)及不同样本不同处理方法微生物组成
 
微生物组取样通常要求样品冷冻保存,以便进行下游处理。因此本研究测试评估了lyPMA对冷冻唾液样品的处理效果(3个参与者唾液样本分别立即于-20℃冷冻或者混合20%甘油后冷冻,3天后,解冻样本并分装,然后类似于新鲜样本的处理方法用lyPMA处理冷冻样本),结果表明未处理样本主要reads为人源DNA reads (84.73 ± 2.56%),用甘油处理的样本的人源DNA含量与新鲜样本处理的结果相似(7.18 ±3.09%),如果没有低温保存,lyPMA的效率就会降低,也会有更多的变数(53.78 ± 27.43%)。
 
 
研究结论
本研究开发了一种渗透裂解及叠氮碘化丙锭处理的新型化学方法(lyPMA)可去除唾液样本中的宿主DNA;与多种方法进行比较分析,结果表明在所有方法中,lyPMA是最有效的去除宏基因组过程中宿主DNA序列的方法,与未处理样本相比,处理后的样本中仅包含8.53%的宿主序列,未处理样本的百分比为89.29%;另外,lyPMA方法处理后的样本中,分类学上的偏差最低。
 
 
亮点
在分析宏基因组样本时,通常会受到宿主DNA的干扰,本文开发的基于渗透裂解及叠氮碘化丙锭处理的新型化学方法或许可解决宏基因组测序中去除宿主污染这一大难题或为其提供相应思路。

 
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