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科研动态

PLoS Neglected Tropical Diseases : 实验性恰加斯病引起的粪便微生物组和代谢组紊乱
发布时间:2018-04-20 14:17   点击率:
导读
克鲁斯锥虫(trypanosoma cruzi)是南美恰加斯病(锥虫病)的病原体。该寄生虫可感染心脏和胃肠组织,引发局部炎症和组织损伤。消化性恰加斯病与食物吸收、肠道蠕动和排便有关。 然而,克氏锥虫感染对肠道微生物组和代谢组的影响尚未确定。在这项研究中,利用处于恰加斯病急性阶段和慢性阶段的小鼠模型,通过粪便的质谱代谢组学和16S rRNA测序,进行感染相关的微生物组和代谢组的关联分析。这种联合方法能够确定微生物组和代谢组的相关变化,并为进一步研究恰加斯病发病机制中克氏锥虫 - 微生物群的相互作用奠定基础。
 
 
文献ID
题目:Experimental Chagas disease-induced perturbations of the fecal microbiome and metabolome
译名:实验性恰加斯病引起的粪便微生物组和代谢组紊乱
期刊:PLoS Neglected Tropical Diseases
时间:2018.3         IF= 4.165
通讯作者:Laura-Isobel McCall
通讯单位:加州大学圣地亚哥分校斯卡格斯药学院
 
 
材料与方法
实验设计
实验样品收集:从Jackson实验室购买的雄性C3H/ HeJ小鼠,在开始实验前2周适应本实验室。在第0天,给20只小鼠通过腹膜内注射1,000只培养的克鲁斯锥虫,作为感染组;给20只小鼠仅注射DMEM培养基,作为未感染组,并收集起始的粪便颗粒。并使用体内成像系统(IVIS)检测寄生虫负荷,判定感染的急性阶段和慢性阶段,每2-3周收集2次粪便样品。
 
液质连用质谱分析(LCMS):使用Compass Data分析软件,对收集到的粪便颗粒进行非靶向质谱分析。
 
测序区域及平台
16S DNAV4区,Illumina MiSeq平台
 
 
研究成果
1、 感染克鲁斯锥虫的小鼠粪便微生物组和代谢组
研究发现,小鼠腹部寄生虫负荷在感染后第35天达到峰值,并且在感染的慢性期降下来(图1A)。通过液质连用质谱分析(LCMS)对收集到的粪便颗粒进行非靶向质谱分析,进行代谢物鉴定。检测到的可识别代谢物包括专门来自胃肠道微生物的次级胆汁酸和色氨酸代谢物等已知产物,可在饮食中发现或被肠道微生物修饰的代谢物共轭亚油酸、由膳食亚油酸产生的衍生物等,以及常见的宿主和微生物代谢物氨基酸和磷脂等。细菌组和代谢组受到寄生虫感染强烈的影响,与未感染和低寄生虫负荷的粪便样品相比,高寄生虫负荷样本(虚线椭圆)微生物组(图1B)和粪便代谢组(图1C)聚集。

图1. 感染克鲁斯锥虫的小鼠粪便微生物组和代谢组
A、在感染的急性阶段和慢性阶段肠道寄生虫负荷进展; B、微生物组主坐标分析(PCoA)(加权UniFrac距离度量);
C、代谢组主坐标分析(PCoA)(Bray-Curtis距离度量),每个点代表在每个给定的时间收集的小鼠粪便样本,黑点代表在感染高峰收集的样品,大点代表在感染之前收集的样品,小点代表其他时间收集的样品;
D、微生物组在感染和未感染样品之间的随机森林分类模型评估;
E、代谢组在感染和未感染样品之间的随机森林分类模型评估。
 
未感染和感染样品,在感染后第21天的代谢组和微生物组之间的区分最佳(图1D和1E)。随机森林分类模型无法区分感染最初样本和未感染样本,分类准确性在感染的急性阶段得到改善,在感染的21天接近完美分类,然后分类错误在感染慢性阶段增加,但分类准确性仍然比感染前好。
 
 
2、 实验性克氏锥虫感染期间小鼠肠道微生物组和代谢组之间的关联

图2. 实验性克氏锥虫感染期间小鼠肠道微生物组和代谢组之间的关联
(A)微生物组和代谢组数据的Procrustes分析。每个点代表在给定时间的一只小鼠粪便样本,黑线表示代谢组数据,红线表示微生物组数据;
(B)通过WGCNA分析(相关系数> 0,p值<0.05)鉴定与共轭亚油酸(CLA)衍生物相关的细菌、OTUs网络关系;
(C)通过WGCNA分析鉴定与胆酸衍生物相关(相关系数> 0,p值<0.05)的细菌、OTUs网络关系。已知代谢物和细菌属由V形表示,所有OTU由圆圈表示. OTU节点颜色由所属的细菌决定,以突出类杆菌目,双歧杆菌目,梭状芽胞杆菌目,乳杆菌目
 
通过Procrustes分析,研究在实验性克氏锥虫感染期间小鼠肠道微生物组和代谢组之间的关联。显示微生物组和代谢组的总体趋势相似:在感染第0天和未感染样品之间没有分离,在第21天清晰分离,在感染后90天观察到较少的分离(图2A)。对微生物组和代谢组数据进行加权基因共表达网络分析(WGCNA),发现代谢产物和微生物被聚集成单独的模块,并且确定了与小鼠体内寄生虫负荷相关的微生物和代谢物模块(p<0.01,相关系数> 0)。在1954个细菌OTUs组成的三种细菌模块中,只有一个模块与寄生虫负荷相关。在49个代谢物模块中, 9个代谢物模块与寄生虫负荷相关。然后在这些相关的微生物和代谢物模块之间进行成对相关分析,显示其中6个模块有显著地相关性。
 
在这6个相关模块对中,几乎所有与寄生虫负荷呈正相关的代谢物都来自不同的分子子网,表明它们是不同代谢家族的一部分。其中,来自最强相关的代谢物模块中,有11个代谢物来自亚油酸衍生物的分子网络(表1)。分子网络表明,亚油酸或共轭亚油酸(CLA)的单一和双重水合产物,与瘤胃菌科和毛螺菌科特定物种相关(图2B)。 CLA在结肠中的吸收是有限的,因此细菌的亚油酸代谢产物主要在局部发挥作用。已有文献表明,在结肠中油酸代谢产物通过促进T细胞富集,降低TNF受体表达和TNFα产生,改变肠道炎症反应,并增加抗炎细胞因子TGFβ。 因此,这些代谢物可以促进肠道微环境健康,有利于增强克氏锥虫抵抗性和胃肠道储库功能。

表1.与寄生虫负荷相关的共轭亚油酸相关分子
 
与胆酸相关的其他5个相关模块的共调制特征(表2)。 m/z 357.281 RT 337s,m/z 357.281 RT 371s和m/z 375.291 RT 393被鉴定为脱氧胆酸不同的紧密异构体或加合物(根据2007年代谢组学标准倡议的第二级注释)。宿主产生的初级胆汁酸(如胆酸)与肝脏中的牛磺酸或甘氨酸结合,原代胆汁盐在胃肠环境中进一步特异性地修饰:肠道微生物群使初级胆汁盐解偶联并除去7-羟基以形成次级胆汁酸(如脱氧胆酸)。

表2.与寄生虫负荷相关的胆酸/脱氧胆酸相关分子
 
已有研究表明,拟杆菌属,双歧杆菌属,梭菌属,乳酸杆菌属和李斯特菌属解离胆汁酸,然后由梭菌和真杆菌脱羟基化。本研究中,梭菌属的中的Clostridium celatum(OTU ID 4315688)与m/z 357.281 RT 337s相关(相关系数0.09079,p值0.00000426),与m/z 357.281 RT 371s和m/z 358.285 RT 371s弱相关(相关系数分别为0.09079和0.09770,p分别为0.049161208和0.034207271)。同样,双歧杆菌属的两个成员与m/z 357.281 RT 371s和m/z 375.291 RT 393s相关,并且乳杆菌属与m/z 357.281 RT 371s,m/z 358.285 RT 371s和m/z 375.291 RT 393s相关。
 
已有研究表明,解离胆汁酸的进一步修饰可由埃希氏菌属,梭杆菌属,消化球菌属,消化链球菌属,瘤胃球菌属等这些属进调节,其中几个也与本研究感染模型中的次级胆汁酸相关(图2C)。 该研究中,与这些次级胆汁酸最强相关的OTUs(相关系数> 0.4)也是梭菌目的成员,它们来自颤螺属或来自不明属。由于肠道微生物群的胆汁酸代谢和局部结肠炎症与健康有关,所有这些都可能影响南美恰加斯病的发病机制。
 
 
研究结论
感染克鲁斯锥虫可诱导小鼠肠道微生物组的改变,通过将微生物群与代谢组数据集成,证明了在查加斯病诱导下的宿主 - 微生物的相互作用,这些微生物改变可能与影响宿主炎症反应的肠道化学环境功能改变相关,如共轭亚油酸(CLA)衍生物和次级胆汁酸的的改变以及瘤胃球菌科,毛螺旋菌科和梭菌目的特定物种改变。这些结果突出了代谢组学和微生物组学研究在理解一般寄生虫病,特别是恰加斯病方面的重要性。
 
 
亮点
作者将微生物组和代谢组进行了联合分析,确定了克鲁斯锥虫寄生虫感染免疫性小鼠模型后,所诱导的肠道相关的代谢组与微生物群的相互作用,为以后一般寄生虫病研究提供了思路,也可能减缓个体由无症状阶段转为症状性疾病的进展。
 
 
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