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科研动态

【锐翌新文】中国帕金森患者的肠道菌群特征
发布时间:2018-04-08 18:15   点击率:
2018年2月16日,锐翌基因与上海交通大学在《Brain Behavior and Immunity》合作发表研究成果《Alteration of the fecal microbiota in Chinese patients with Parkinson’s disease》。作为共同通讯单位,锐翌基因承担了测序分析以及数据深度挖掘工作。


文献信息
英文题目:Alteration of the fecal microbiota in   Chinese patients with Parkinson’s disease
中文题目:中国帕金森患者肠道菌群特征
发表期刊:Brain Behavior and Immunity
发表时间:2018      影响因子:5.964
通讯作者:
1. 陈生弟、肖勤,上海交通大学医学院附属瑞金医院
2. 秦楠,锐翌生物科技
测序产品:16S扩增子测序
测序平台:Illumina Miseq,PE300
检索:doi.org/10.1016/j.bbi.2018.02.016


研究背景
帕金森综合征(Parkinson’s disease,PD)是一种进行性神经退行性疾病,伴有运动和非运动症状。随着我国人口老龄化进程的加快,PD的发病人数逐年增加,目前中国65岁以上人群中的PD发病率约为1.7%,患者人数已超过200万。

PD的主要病理变化为α-突触核蛋白(a-synuclein, α-syn)的异常聚集导致中脑黑质部多巴胺能神经元的选择性丢失和残存神经元胞浆内路易小体(Lewy body, LB)的形成。而PD的病因尚不清楚,众多研究表明PD的临床症状和病理变化都显示肠道功能障碍的发生早于典型的PD运动症状和病理特征(α-synuclein蛋白形成)。

近期研究发现肠道菌群紊乱在PD发病中起到重要的作用,但中国PD患者粪便菌群的变化尚不明确。本研究收集了45名PD患者及其健康配偶的粪便样本,并记录疾病临床指标,对粪便进行16S rRNA基因V3+V4区测序,分析肠道菌群与PD临床指标之间的关系。


材料与方法
研究对象
疾病组(D):45名PD患者(平均年龄68.1岁,其中23名为女性)
健康组(H):45名PD患者的健康配偶(平均年龄67.9岁,其中22名为女性)
排除标准:患有严重慢性病,如IBS、糖尿病、心力衰竭、肝硬化、恶性肿瘤、血液病或自身免疫性疾病等。取样三个月前使用抗生素或补充益生菌均不纳入研究。

临床指标
BMI值、病程、起病年龄、Hoehn和Yahr分期、统一帕金森病评分量表UPDRS、药物治疗、运动并发症、左旋多巴等效剂量(LED)、非运动症状(汉密尔顿焦虑量表HAMA、汉密尔顿抑郁量表HAMD、轻度精神状态检查MMSE和北京版蒙特利尔认知评估MoCA。便秘的评定根据经典罗马III诊断标准。在PD患者的开期时评定UPDRS和H&Y分期。

测序策略
Illumina Miseq,PE300;16S rRNA基因V3+V4区域。

 


研究成果
1. PD组与健康组的基本特征
两组的年龄、性别和BMI值均没有差异。PD组患便秘的比例高于健康组(53.3% VS 6.7%, P < 0.001)。PD组H&Y阶段平均为2.2±0.7,起病年龄为62.6±8.1岁,病程5.7±4.1年,UPDRS总分为38.4±18.8。

此外,所有PD患者都使用了抗帕金森药物。患者平均LED剂量为427.4±259.9 mg/day,16个病人(35.6%)诊断有运动并发症。

 
表1. PD组与健康组的人口学特征

注:H&Y(Hoehn & Yahr)分级:评估PD的严重程度。UPDRS:统一帕金森病评分量表。

2. PD组与健康组的肠道菌群多样性改变
PD组肠道菌群的多样性指数(Chao1,observed species,PD whole tree,shannon,simpson)均显著高于健康组,说明PD组肠道菌群多样性高。β多样性分析显示两组差异显著(基于unweighted Unifrac聚类,ANOSIM R=0.027,P=0.038),表明在OTU水平下,PD组与健康组肠道菌群结构存在显著差异。

 

图1. PD组与健康组中菌群的α多样性分析与β多样性分析

3. PD组和健康组肠道微生物差异
LEfSe分析显示,健康组LactobacillusSediminibacterium属丰度比PD组高,而Alistipes、Paraprevotella、Klebesiella、Sphingomonas、Acinetobacter、Aquabacterium、Desulfovibrio、Clostridium IV、Butyricicoccus、Clostridium XVIII、Lachnospiracea incertae sedisNitrososphaera属在PD组中丰度更高。

使用GLM算法控制了其他因素(年龄、性别、BMI和便秘)后,判断对两组之间差异起主要作用的菌属。PD组和健康对照组肠道菌群之间的差异主要与菌属Clostridium IV、Holdemania、Clostridium XVIII、Butyricicoccus、Anaerotruncus、AquabacteriumSphingomonas有关 (P < 0.05),并且这些菌属均在PD组中富集,与PD相关。

4. 疾病预测模型(Random forest)
为了预测PD疾病状态,我们使用来自Wilcoxon秩和检验得到的差异菌属丰度作为输入变量,通过RF方法建立了基于肠道菌群概况的预测模型。在肠道菌群中,通过RF模型得到18个菌属可以预测PD。模型平均分类误差为0.18,AUC值为0.807(95%CI:0.72-0.90,灵敏度75.6%,特异度77.8%)。

图2. PD患者与健康人肠道菌群差异分析

5. 菌群功能预测
通过PICRUSt预测肠道微生物的功能,发现两组间有27个KOs存在显著差异(FDR,P<0.05)。健康对照组中基因功能较高的是辅因子和维生素代谢、卟啉和叶绿素代谢以及生物素代谢有关的途径,而在PD组中较高的功能是能量代谢、黄酮和黄酮醇生物合成,脂肪酸生物合成和细胞凋亡途径。

图3. PD患者和健康人肠道菌群的功能预测分析

6. 临床指标与PD患者肠道菌群关联分析
大部分菌属与病程(如Saccharibacteria genera incerta sedi,P <0.01),严重程度(例如Comamonas与UPDRS总分和第III部分评分,P<0.01)和LED(例如Intestinimonas,P <0.01)呈负相关。使用广义线性模型控制其他变量进行校正后,没有粪便菌属与H&Y stage、UPDRS评分有关。Escherichia/Shigella与病程负相关。Dorea、Phascolarctobacterium属与LED负相关 。

有35.6%的患者出现运动并发症。存在运动并发症的患者较没有运动并发症的患者有29种显著不同的菌属(P<0.05),矫正后Aquabacterium、Peptococcus、Sphingomonas属和运动并发症相关。

我们还发现肠道菌属与非运动症状之间存在相关性(例如,菌属Bifidobacterium与NMS评分,ButyricicoccusClostridium XlVb与MMSE评分,P <0.01)。在有相关性的菌属中,大部分菌属与认知功能障碍程度呈正相关。使用广义线性模型控制其他变量进行校正后,没有菌属与NMS评分、HAMA和HAMD评分相关。只有属ButyricicoccusClostridium XlVb与MMSE评分呈正相关。。

图4. 属水平物种与PD临床指标相关性热图分析


研究结论
1、PD患者和健康配偶间肠道菌群组成及丰富度存在显著差异,在控制年龄、性别、BMI值和便秘等因素后,发现PD患者肠道中富集了菌属Clostridium IV、Aquabacterium、Holdemania、Sphingomonas、Clostridium XVIII、ButyricicoccusAnaerotruncus

2、Escherichia/Shigella与PD病程呈负相关;DoreaPhascolarctobacterium属与左旋多巴等效剂量(LED)呈负相关。Butyricicoccus、Clostridium XlVb与认知障碍程度有关。

3、通过随机森林模型分析得到18个菌属可用于预测PD疾病,其AUC值为0.807。

4、功能预测分析中,27个KEGG Orthologs在PD患者患者与健康人中存在差异,健康组中富集了与辅酶因子和维生素的代谢、卟啉和叶绿素代谢、生物素代谢等相关的代谢途径;而PD患者组中富集了与能量代谢、黄酮和黄酮醇生物合成、脂肪酸合成、凋亡途径等相关的代谢途径。

5、我们确认了中国PD患者存在肠道菌群失衡,通过严格入组的配对样本,发现了与PD临床指标紧密相关的微生物。本研究有利于进一步理解PD的发病机理,使调节肠道菌群成为潜在的治疗PD手段。

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