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科研动态

Bioresource Technology:生物碳对养牛场废水厌氧消化过程中抗生素抗性基因及可移动遗传因子环境风险的影响
发布时间:2018-04-14 14:28   点击率:
2018年2月13日,锐翌基因协助西北农林科技大学在《Bioresource Technology》发表了《Impacts of biochar on the environmental risk of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements during anaerobic digestion of cattle farm wastewater》,其中微生物16S扩增子测序分析工作由锐翌基因完成。今天就带大家一起来了解一下这篇文章的精彩内容!
 
导读
厌氧消化作用是处理畜禽废水的主要方法之一,它能够产生甲烷并杀死病原菌,废渣可以用作有机肥。厌氧消化过程中微生物群体的变化会影响抗生素抗性基因(ARGs)基因的丰度,同时主要由整合子、转座子、插入序列等组成的可移动遗传因子(MGEs)会极大的促进AGRs基因在环境中的转移。然而,以前关于厌氧发酵过程中MEGs变化的研究主要集中在整合子,其他的则关注相对较少。在有机固体废物的处理过程中使用添加剂能够提高ARGs基因的移除效率。有机物在高温低氧条件下裂解产生的生物碳是一种环境友好的材料,经常被用来修复土壤,取得了很好的效果。生物碳的大比表面积可能会影响微生物群落,可能会通过吸收厌氧发酵系统中的抗生素、重金属等物质来降低对ARGs的选择压力,从而降低ARGs的丰度。然而,生物碳对畜禽废水厌氧消化过程中ARGs和MGEs丰度的影响目前尚未见报道。为探究生物碳对ARGs和MGEs的作用,四个浓度梯度的生物碳(0,5,20,50g/L)被添加到牛粪厌氧消化系统中来模拟牲畜废水处理过程,测定生物碳的添加对厌氧消化中ARGs、MGEs和微生物群落丰度的作用,从而评估出生物碳对ARGs和MGEs环境风险的影响。
 

文献ID
题目:Impacts of biochar on the environmental risk of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements during anaerobic digestion of cattle farm wastewater
译名:生物碳对养牛场废水厌氧消化过程中抗生素抗性基因及可移动遗传因子环境风险的影响
期刊:Bioresource Technology   IF=5.651
通讯作者:谷洁
通讯单位:西北农林科技大学资环学院
 
 
材料与方法
实验设计
牛粪搜集自杨凌一家有800头牛的养殖场,特性如下(总固体含量=80.3%,pH=8.41,总碳含量=414.2 g/kg,总氮含量=17.8 g/kg)
生物碳来自浙江生物碳工程技术研究中心,由竹子在600°C高温无氧的火炉中裂解而成。特性如下,pH=9.8,总碳含量=86.9%,总氮含量=0.69%,总磷含量=0.11%,总K含量=0.56%,比表面积= 189.6m2/g,总孔隙容积= 0.175 cm3/g)。
消化反应器由75个相同的250ml锥形瓶组成,每个的工作体积为150ml。每个消化反应系统中加入15克牛粪,生物碳添加的浓度分别为0 (CK),5 (BC5),20 (BC20),和50 g/L (BC50)。每隔0,5,15,30,60天随机取样,每处理各取3个重复。
 
测序区域及平台
16S rDNA V3-V4区,Illumina HiSeq PE250平台
 
 
研究成果
1、生物碳在厌氧消化过程中对抗生素抗性基因(ARGs)的影响
BC50会显著增加消化产物中sul基因和总ARGs 的相对丰度。由图一的热图可以看出,tetW和sul1的相对丰度在消化开始时最高。生物碳会降低发酵过程及产物中tetX和qnr基因的相对丰度。同时,BC20条件下tetW的相对丰度比对照低,能够显著减少发酵产物中tet基因的相对丰度,只有对照的71.6%。对照中qnrA、qnrS和aac(6’)-ib-cr的相对丰度在厌氧消化末期最高,对照中总qnr基因相对丰度比添加生物碳处理显著更高(P<0.009),是BC5中的1.4倍,BC20中的1.77倍。
 
但生物碳的添加也会使得一些ARGs基因的相对丰度增加,如生物碳处理的消化产物中tetC在第30天相对丰度显著比对照高(P<0.008),其中BC5比对照高2.32倍,BC20比对照高2.52倍。一般来说,添加不同数量的生物碳对ARGs基因的影响不一致。BC50会使得ARGs的绝对丰度较对照增加1.88倍,从而不适合用来除去养殖场废水厌氧发酵过程中的AGRs,推测是因为过量添加的生物碳中含有的重金属会增强对ARGs的选择压力。BC5会减少消化产物中13种ARGs中5种基因的相对丰度而BC20则会减少其中7种基因的相对丰度,推测是因为5g/L和20g/L的生物碳会吸附消化产物中的抗生素。

图1. 厌氧消化过程中抗生素抗性基因相对丰度的变化情况(n=3)
 
 
2、生物碳在厌氧消化过程中对可移动遗传因子的影响
ARGs能够被MGEs携带传播到不同的细菌中去,从而MGEs的丰度可以反映AGRs的环境风险。图2中所示,消化产物中4种MGEs的相对丰度在所有处理中均比刚开始混合时高,说明厌氧发酵会促进养牛场废水中ARGs基因在环境中传播的风险。Tn916/1545是丰度最高的MGE,大约是intI1的79-143倍,intI2的53-64倍,这与前人研究发现的intI1丰度最高不一致,推测是因为Tn916/1545的宿主是厌氧细菌,而intI1的宿主是需氧的。5g/L的生物碳只会减少ISCR1的相对丰度,对消化产物中的intI1、intI2、Tn916/1545没有显著性影响。20g/L的生物碳添加处理会使得ISCR1和 Tn916/1545的相对丰度在厌氧发酵进程的绝大多数处理时间下维持在一个较低的水平。生物碳会抑制厌氧消化产物中所有MGEs总体的丰度,20g/L生物碳的抑制作用会强于5g/L生物碳的作用,说明生物碳能降低ARG基因传播的环境风险。 

图2. 厌氧消化过程中可移动遗传因子相对丰度的变化情况(n=3)
 
 
3、抗生素抗性基因(ARGs)与可移动遗传因子(MGEs)的共现关系
图3a中有11个ARGs和4个MGEs,图3 b中有9个ARGs和3个MGEs。生物碳的添加会改变ARGs和MGEs的共现关系。结果显示intI2的丰度高于intI1,且前者在厌氧消化中ARGs基因的水平转移中具有关键的作用。ISCR1在对照中是厌氧发酵过程中抗性基因水平转移(HGT)的第二重要MGE,添加了生物碳的处理会弱化ISCR1在HGT中的功能,同时显著减少ISCR1在消化产物中的相对丰度(P<0.001)。生物碳弱化ISCR1和intI1功能的同时会增强Tn916/1545在厌氧消化中HGT的作用。生物碳的添加不会改变共现网络中ARGs的热点,tetG、sul1、sul2、qnrA、qnrS、ermX保持与7-10个节点连接,同时,连接tetX的节点由一个增长为四个,可能会使其更加难以被清除。
 
 
图3. (a)对照组中的ARGs与MGEs的网络分析 (b)添加了生物炭的处理组中ARGs与MGEs的网络分析。线条的粗细代表相关系数,圆点的大小指示消化产物中ARGs和MGEs的相对丰度。
 
 
4、微生物群落
最初每个处理的微生物群落都是相似的。从开始到第五天,厚壁菌门的相对丰度则从58.2%-62.1%降至17.4%-23.3%,而广古菌门的丰度则从10.9%-13.0%提升至39.1%-49.8%,预示着该系统开始进入厌氧阶段。5天后,古菌群落维持稳定、丰度一直超过25.1%,主要由甲烷八叠球菌属、甲烷囊菌属、甲烷短杆菌组成。
 
图4. 热图展示了厌氧消化过程中最低相对丰度大于1% 的微生物群落。黑色方框表示未检测到的微生物,红色字体的微生物代表是古生菌。
 
 
5、厌氧消化过程中ARGs和MGEs的潜在宿主细菌
图5中有48条连线,每个基因有四个潜在的宿主细菌,每种菌属平均有3.7个ARGs/MGEs这个网络被分为两个模块,其中一个模块只包含纤维杆菌属和tetC,也就是说纤维杆菌属是tetC唯一的潜在宿主,该细菌在厌氧消化中的主要作用是降解纤维素。SCOD的值显示添加生物碳的处理纤维素的降解程度要比对照彻底,说明生物碳会刺激细菌降解纤维素的活动,从而厌氧消化中期,生物碳处理中的纤维杆菌属和tetC的相对丰度要比正常对照高。另外的一些基因和微生物组成第二个模块,中心是由intI2和Tn916/1545两个MGEs组成,分别连接8种、7种微生物,它们潜在的宿主细菌共有11种。

图5. ARGs和MGEs潜在宿主细菌的网络分析。圆点的大小代表厌氧消化产物中基因和细菌总的相对丰度。连线表示极显著正相关(P<0.001)。
 
6、ARGs、MGEs 和微生物群落之间的关系
RDA1和RDA2解释了全部样品中90.7% ARGs的差异性。互养菌门、伯克氏菌目、与pH、绝大多数ARGs正相关,由Tn916/1545、IntI2 和ISCR1组成的MGEs也与大多数ARGs正相关。

图6. ARGs、 MGEs、 微生物群落和环境因子关系的冗余分析
 

研究结论
1、5 g/L和20 g/L生物碳的添加会对应降低养牛场废水消化产物中5种和7种ARGs基因的相对丰度,特别是qnr基因。
2、20 g/L的生物碳对微生物群落具有更大的影响也会刺激厌氧消化的进程,且会降低整个厌氧消化进程中ISCR1的丰度从而降低ARGs传播的风险。
3、生物碳主要是通过影响厚壁菌门和变形菌门来影响ARGs基因的分布。MGE中的intI2对ARGs基因在添加了生物碳的厌氧消化系统中的传播具有非常重要的作用,其次就是ISCR1。
 
 
亮点
通过实验模拟了养牛场废水厌氧发酵的过程,探究了不同添加量的生物碳对抗生素抗性基因、可移动遗传因子、微生物群落的影响,具有重要的理论价值与应用价值。

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