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科研动态

Scientific Reports:尿道感染微生物的宏基因组分析
发布时间:2018-04-11 14:19   点击率:
导读
尿液培养和显微技术是判定尿道感染细菌种类的主要方法。有用16S rDNA测序分析尿液微生物的相关报道,也有用WGS(whole genome sequencing)分析尿道感染样本的相关报道。但这两种方法的互补性和每种方法的特性都没有得到很好的研究。为了解决这一问题本文采用了16S rDNA测序和宏基因组测序两种技术对尿道微生物进行研究。
 
 
文献ID
题目:Microbial metagenome of urinary tract infection
译名:尿道感染微生物的宏基因组分析
期刊:Scientific Reports          IF=4.259
发表时间:2018年3月12日
通讯作者: Rembert Pieper 和 Amalio Telenti
通讯单位:Human Longevity Inc., San Diego
 
 
材料与方法
实验设计
样本:病理学和临床微生物实验室收集的121个人的中段尿液样本,其中女性92个,男性29个。
 
测序区域及平台
16S rDNA测序(Illumina MiSeq平台)
宏基因组测序(Illumina Hiseq平台)
 
 
研究成果
1. 临床试验数据
以实验室对尿液进行分析的20个参数为依据,对标本进行分类,图1A代表20个成分参数,前2个主成分的差异度较大,PC1和PC2被保留下来进行后续分析。图1B代表PC1和PC2的贡献因子,PC1的主要贡献度因子是阴道污染(VCO),PC2的主要贡献度因子是嗜中性粒细胞的激活和脱粒(NAD),其次是红血球和血管损伤(ERY)因子、存在的红细胞(RBC)和白血球(WBC)因子。图1C是PCA聚类结果,将样本聚为三类。9个样本聚为Cluster 1,63个样本聚为Cluster 2,49个样本聚为Cluster 3。根据以上数据判断Cluster 1为非感染个体,Cluster 2和 3为有临床感染症状和尿道炎症发生患者。
 

图1. 临床和实验室对样本的分组情况
 
 
2. 16S rDNA测序
16S rDNA测序成功的样本共116个,平均每个样本产生的高质量reads数 为39288(2 × 300 bp)。平均每个样本鉴定到的属为38个(6–220)。三个组鉴定到的属水平物种平均分别为:Cluster 1为51 (16–106)个 , Cluster 2为32 (7–172)个 , Cluster 3为60 (6–220)个。对细菌属水平丰度进行分析发现,变形菌门是Cluster 2的优势门类,其优势属水平为柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属。而Clusters 1 和 3 的组成更加多样性(如图2)。
 

图2. 细菌属水平丰度的标准化
 
 
3. 宏基因组测序
宏基因组测序成功的样本共49个,平均每个样本产生的双端高质量reads数为2660万,去除宿主序列后(1.3%-99.9%),平均每个样本有426万条reads用于分析。如图3所示,界水平reads的平均组成为94.6% 细菌, 0.05%真核生物, 0.0027% 病毒,  0.0001% 古菌。古菌在随后的分析中被忽略。有4.9%的reads没有比对上。Cluster 1中微生物含量最多,Cluster 3中最少。
 

图3. 宏基因组测序样本map上的reads数
 
细菌
如图4所示,三个组平均鉴定到的细菌数为,Cluster1鉴定44种,Cluster2鉴定41种,Cluster3鉴定38种。图4描述了不同临床分组的属水平reads数和每个属下覆盖率最高的株。其中有9个属下的27株菌的基因组覆盖率>90%,有33个属下的411株菌的基因组覆盖率>50%。分析表明,变形菌门是cluster2的优势菌门。Cluster 1 中有较高丰度的Actinomyces, Anaerococcus, Atopobium, Facklamia, Finegoldia, Gardnerella, Lactobacillus, Megasphaera, Peptoniphilus, Staphylococcus,和 Streptococcus。考虑到cluster3中reads总数较少,无法鉴定出优势菌属。宏基因组测序可以鉴定细菌的毒力因子,用VFDB数据库识别毒力因子,结果发现cluster2中富集了大量特异的毒力因子(如图5所示)。
 

图4. 根据reads数对细菌属水平进行分类
(每个点代表样本中的一个属,水平线代表该属的中位数)
 

图5. 细菌毒力因子分布
 
真核生物
如图6所示,共有9种真核生物被鉴定出,8个真菌和一个后滴门类。在Clusters 2 和3 的四个样本中发现了大量的C. glabrata 和 Clavispora lusitaniae ,念珠菌属所有物种的定居均可在泌尿道引起侵入性疾病。此外,Trichomonas vaginalis(阴道毛滴虫)可以定居在男性和女性的泌尿生殖道系统,有临床症状而未确诊的年轻女性与已确诊患者相比,尿道中更有可能出现阴道毛滴虫。
 
图6. 不同临床分组样本中的真核生物reads数
(显示的真核生物在一个样本中至少有10条reads,每个点代表样本中的一个物种)
 
病毒
在49个样本中鉴定到了13种与同族细菌相关的优势噬菌体和6种人类病毒。

图7. 不同临床分组样本中的病毒reads数
(显示的病毒在一个样本中至少有1条reads,每个点代表样本中的一个物种)
 
 
研究结论
1.16S rDNA测序成功了116个样本,具有较高的灵敏度。
2. 宏基因组测序成功了49个样本,相较于16S rDNA灵敏度较低。
3. 宏基因组测序对病原体的鉴定更全面,包括细菌、真核生物、病毒和细菌毒力因子,全面地和定量地描述了尿道微生物组的特性。
 
 
亮点
1. 对临床诊断后的样本再次进行分析,将“医疗废物”变废为宝。
2. 该研究摒弃传统经典分析,最大程度的利用实验室数据特征,并将它们与宏基因组方法相结合,提供了一种无偏见识别区分阴道共生生物、污染物和感染的方法。


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