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科研动态

Science :共生菌群与转移性黑色素瘤患者的抗PD-1疗效相关
发布时间:2018-03-06 17:02   点击率:
导读
基于抗PD-1(程序性死亡受体1,是一种重要的免疫抑制分子)的免疫治疗对癌症有奇效,但是仅针对部分人群,这种治疗效果的差异可能是由于病人肠道微生物组成的差异引起的异质性造成的。本研究综合16S测序、宏基因组测序、定量PCR方法,分析了转移性黑色素瘤患者们的肠道微生物构成,以期揭示患者的菌群构成和抗PD-1免疫疗法效果之间存在的关联。
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文献ID
题目:The commensal microbiome is associated with anti–PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients
译名:共生菌群与转移性黑色素瘤患者的抗PD-1疗效相关
期刊:Science
年份:2018年1月    IF=37.205
通讯作者:Thomas F. Gajewski
通讯单位:芝加哥大学病理科
 
材料与方法
实验设计
样本:免疫治疗前转移性黑色素瘤患者粪便(n=42;38名患者接受抗PD-1抗体药物治疗,4名患者接受一种相关的抗CTLA4抗体药物治疗;治疗后16名患者(38%)对治疗作出响应(R),26名患者(62%)对治疗不响应(NR)
 
测序方法
16S测序(42名患者粪便、91份小鼠粪便)、宏基因组测序(39名患者粪便)
其他方法:定量PCR等(如图1所示)
 
 
图1 方法流程示意图
A. 微生物鉴别方法的整合;B. 肿瘤相关生物标记物的分析; C. 小鼠肠道微生物测序
 
 
研究成果
1、基于16S rRNA测序分析的,针对抗PD-1治疗效果响应与不响应患者的肠道微生物群落结构
 
 
 
图2 基于16S rRNA测序分析的,针对抗PD-1治疗效果响应与不响应患者的肠道微生物群落结构
 A. 响应患者与不响应患者的差异OTUs相对丰度(*表示进一步用于小鼠实验的样本); B. 相对丰度的PCA图
 
移除在低于10%样本中存在的OTU后,63个OTUs在R与NR中存在差异,OTUs的相对丰度以热图的形式展现在图2A中,其中40个OTUs在R中丰度高于NR,而23个OTUs在NR中含量更高。PCA分析(图2B)进一步揭示了R与NR微生物群落间存在显著性差异。
 
图3 抗PD-1治疗效果与患者肠道微生物的关联
A. 16S测序的OTU 559527与宏基因组测序的Bifidobacteriaceae的相对丰度的Spearman相关性
B. 通过16S测序的OTU 559527的相对丰度与通过宏基因组和qPCR鉴定的B. longum的相对丰度的相关性
C. 响应患者与不响应患者的OTU 559527(16S测序,左边)、B. longum(宏基因组,中间;qPCR,右边)相对丰度
D. 响应与不响应患者差异物种的qPCR得分(16S、宏基因组、qPCR共同决定的10个差异物种)
E. 有益OTU与非有益OTU的比例相对于RECIST的变化(虚线处表示RECIST% = –30 and ratio = 1.5)
 
2、抗PD-1治疗效果与患者肠道微生物的关联
为得到更加精确的种水平的特征,对39个样本进行宏基因组测序,分析得到43个物种与16S测序中的63个差异OTUs相似,用qPCR方法进一步鉴定这些物种,三种方法共鉴定到10个物种在R与NR中存在差异。Enterococcus faeciumCollinsella aerofaciensBifidobacterium adolescentisKlebsiella pneumoniaeVeillonella parvulaParabacteroides merdaeLactobacillus sp.Bifidobacterium longum 8个物种在R中富集,而Ruminococcus obeumRoseburia intestinalis在NR中富集。
 
B. longum的分析如图3所示,宏基因组及qPCR检测到的B. longum与16S测序鉴定到的OTU 559527成正相关(图3B),且OTU 559527与B. longum在R中的含量均显著高于NR(图3C)。
 
图3E显示有益OUT个数(响应组中富集的OTU个数)/非有益OUT个数(不响应患者中富集的细菌个数)为高,表示此时更有利于治疗效果。  
图4 人体共生微生物在黑色素瘤小鼠中的抗肿瘤免疫
A. 小鼠灌服2周供体粪便后注射B16.SIY黑色素瘤细胞,瘤块随时间变化的大小;
B. 患病供体定植在小鼠肠道的207个OTUs的相对丰度,OTUs丰度在肿瘤生长较慢的组和较快的组中丰度存在差异
C. 肿瘤感染3周后脾细胞活性
D、E. CD8+ T细胞、FoxP3+ CD4+T细胞含量
F. 抗PD-L1治疗A、B两组小鼠后肿瘤的大小
G. A、B两组小鼠关键肠道微生物相对丰度
 
3、人体共生微生物在黑色素瘤小鼠中的抗肿瘤免疫
为研究人体肠道微生物增强抗肿瘤T细胞反应的能力,以小鼠作为受试对象展开后续研究。收集3名对免疫治疗有良好响应的患者(P09、P28、P34,图2、图4标星号处)和3名不响应患者(P06、P11、P21,图2、图4标星号处)的粪便移植到无菌小鼠体内,2周后喂食B16.SIY黑色素瘤细胞。
 
接受对免疫治疗作出响应的患者粪便的3组小鼠中,2组小鼠肿瘤生长缓慢;接受对免疫治疗不响应的患者粪便的3组小鼠中,两组小鼠肿瘤快速生长(图4A)。此结果表明人体粪便微生物能控制小鼠肿瘤的生长,但并不是对所有的小鼠都适用。 
 
4、16S测序评估已成功定植人体微生物的老鼠肠道微生物组成
为更加深入地研究机制,将目光聚集在A(移植对免疫治疗作出响应的患者粪便)和B(移植对免疫治疗不响应的患者粪便)两组老鼠上,A和B的两组独立重复实验在肿瘤生长速度和微生物定植上表现出高度的稳定性(图4B A1 VS A2;B1 VS B2)。
 
注射3周B16.SIY黑色素瘤细胞后A组小鼠T细胞应答增强(图4C),同时分析肿瘤微环境也表明SIY-specific CD8T细胞数量显著增加(图4D),但FoxP3+ CD4+T细胞细胞数量在两者间没有显著性差异(图4E)。肠道中特定的细菌存在可能促进T细胞浸润到肿瘤微环境中,并提高T细胞对癌细胞的杀伤作用,从而增加产生强效且持久的免疫反应。
 
用抗PD-L1治疗A、B两组小鼠,仅在A组中表现出效果 (图4F),表明肠道微生物在体内免疫治疗中的重大作用。
 
用qPCR定量分析A、B两组小鼠粪便中上述10种微生物,6种表现出显著性差异 (图4G)。
 
研究结论
1、 患者的菌群构成和抗PD-1免疫疗法的效果之间存在显著关联,在响应患者中Enterococcus faecium、Collinsella aerofaciens、Bifidobacterium adolescentis、Klebsiella pneumoniae、Veillonella parvula、Parabacteroides merdae、Lactobacillus sp.、及Bifidobacterium longum 8个物种富集,而不响应患者中Ruminococcus obeumRoseburia intestinalis富集;
 
2、 有益细菌在对治疗有响应的患者中更为常见,而非有益细菌是对疗效无响应患者的肠道优势菌。有益细菌与非有益细菌的比值是预测临床响应强有力的一个因子;
 
3、 给无菌小鼠移植对抗PD-1抗体有响应的患者的粪菌,可明显改善肿瘤控制、增强T细胞应答,获得更好的抗PD-1疗效;
 
4、 特定菌群可影响癌症患者的抗肿瘤免疫,也可作为预测患者能否响应免疫检查点阻断疗法的生物标志物。
 
亮点
本研究用16S测序、宏基因组测序、定量PCR等方法揭示了特定肠道细菌与对抗PD-1免疫治疗药物作出的临床反应之间存在着较强的关联性,表明了特定的细菌可明显地提高患者的抗肿瘤免疫反应。同时也更加说明了肠道菌群的作用比我们之前想象的更加深远。该研究表明有益细菌在响应患者中更为常见,也提示我们益生菌在免疫治疗方面可能有重要作用。
 
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