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科研动态

Nature:孕期感染导致后代神经发育障碍的机理
发布时间:2017-12-07 18:12   点击率:
导读
已有大量动物研究表明,母本免疫激活(Maternal immune activation, MIA),会诱发后代行为异常和神经发育障碍。在人类研究中发现,胎儿暴露于具有炎症的母本会增加发生自闭谱系障碍的概率,并且已知与肠道菌群和IL-17a水平的升高有关。本研究进一步探讨IL-17a水平升高的机理,发现只有母本肠道中存在促进TH17细胞分化的细菌、孕期感染两者同时满足,后代才会出现行为异常和神经发育障碍。


文献ID
标题:Maternal gut bacteria promote neurodevelop mental abnormalities in mouse off spring
译名:母本肠道菌群诱发后代神经发育障碍
期刊:Nature
年份: 2017      IF = 40.137
通讯作者:Sangdoo Kim   Hyunju Kim
单位:马萨诸塞州大学医学院


研究思路及方案
1. 肠道细菌的存在是否与后代疾病有关(万古霉素处理)
2. 什么细菌在起作用(q-PCR)
3. 该细菌是否为起作用的主要因素(有无特定菌SFB的小鼠模型)
4. poly(I:C)和SFB对后代小鼠的影响是在孕期还是哺乳过程中(交叉母本哺乳)
5. IL-17a水平升高的机理探索(分离培养相关细胞)
6. 人鼠模型(患有溃疡性结肠炎人粪便中的20株菌转入小鼠+单菌验证)

后代小鼠行为测试:包括焦虑、刻板行为、交流能力、探索行为。(实验方法详见全文)


研究成果
一、MIA母本肠道细菌的存在与后代行为异常和神经发育障碍有关
本研究使用Poly(I:C),一种人工合成的双链RNA模拟病毒感染过程,构建免疫激活母本模型。具体为,先用万古霉素处理母本,并且在胚胎期每隔一天进行万古霉素处理,然后在胚胎期第12.5天进行poly(I:C)诱导,胚胎期14.5天抽取血液样本,后代小鼠分别在9天、8周、9周龄进行行为测试(图1)。


图1. 万古霉素处理实验设计

结果表明经万古霉素处理的母本血浆IL-17a水平与对照组不存在显著差异,其生产的后代在行为上与对照组不存在显著差异,并且大脑皮层无损伤,验证了母本肠道中相关细菌的存在与后代行为异常和神经发育障碍有关(图2)。


图2. MIA母本肠道细菌引起后代行为异常和大脑皮层损伤

二、发现SFB的存在与后代精神类疾病有关
前期已有研究证实鼠小肠内定植着一种微生物——单联丝状分支细菌(segmented filamentous bacterium, SFB),这种细菌能够在小肠固有层诱导CD4+T cells,对小肠中TH17细胞的分化起重要作用,并且对万古霉素敏感。q-PCR结果显示,万古霉素处理后肠道中的SFB含量下降,并且回肠粘膜上没有观察到SFB的黏附(图3)。


图3. 万古霉素处理组SFB含量下降

三、单一SFB因素对后代行为和神经发育的影响
选择缺失SFB的母本Jax和含有SFB的Tac母本进行对比实验(图4),发现Jax母本血浆中IL-17a水平与对照组不存在显著差异,回肠粘膜上没有观察到SFB的黏附,后代行为正常,大脑皮层无损伤。

进一步将Jax与Tac进行混养或给Jax灌胃来源于Tac肠道的粪便样品,发现两种处理后的Jax母本血浆中IL-17a水平显著升高,回肠粘膜上出现SFB,后代行为异常,大脑皮层出现损伤,该实验验证了单一SFB因素对母本IL-17a水平、后代行为和神经发育的重要影响(图5)。

 
图4. 单一SFB因素影响实验设计




图5. 单一SFB因素对母本IL-17a水平、后代行为和神经发育的影响结果

四、poly(I:C)和SFB在孕期起作用
为了进一步确定poly(I:C)和SFB对后代小鼠的影响发生在孕期还是哺乳期,交叉母本哺乳后代小鼠。图6表明只要是来源于Poly(I:C)母本的后代,即使由PBS母本哺乳,后代依旧出现行为异常。图7表明只要是来源于Tac母鼠的后代并且在孕期有Poly(I:C)诱导,即使由Jax母本哺乳,后代依旧出现行为异常。结果表明,poly(I:C)和SFB在孕期起作用。

 

图6. 交叉母本哺乳Poly(I:C)和PBS后代


图7. 交叉母本哺乳Jax和Tac后代

五、IL-17a水平升高的机理研究
图8a表示SFB和poly(I:C)同时在孕期作用,导致母本IL-17a水平升高。图8b表示得有SFB+DC+CD4 T cells同时存在才能实现IL-17a水平升高。图8c表示敲除TLR-3后,即使有CD4和DC存在也无法使得IL-17a水平升高。

综合图8分析肠道菌群免疫机理,Poly(I:C)激活DC细胞上的TLR-3受体,它促进T细胞分化产生CD4 T cells,CD4 T cells可以产生IL-6、IL-23,TGF-β,这些因子诱导TH17分化,进而产生IL-17a,使其水平升高。并且由于在Poly(I:C)注射后12-24小时内就出现IL-17a水平的升高,提示起诱导作用的是已经存在的TH17细胞,而非重新分化获得。

此外,图8f对怀孕和未怀孕母本血浆IL-17a水平进行检测,发现Poly(I:C)仅能使得怀孕母本IL-17a水平升高。


图8. IL-17a水平升高机理研究

六、人鼠模型
将来源于人类的20株细菌混合物(表1)分别在孕期第3.5和10.5天灌胃至母鼠,检测母鼠血浆IL-17a水平,并对后代进行行为测试(图9)。

表1. 来源于人类肠道的20株菌



图9. 人鼠模型实验设计

结果表明,移植人类细菌的母鼠血浆中IL-17a水平升高,后代出现异常行为和神经发育障碍。但是很有趣的是,母鼠回肠中并没有检测到SFB菌的存在,提示了人和小鼠研究的差异,对小鼠有作用的SFB菌可以被其它代替,来源于人类的一些菌可以活化TH17分化,从而产生影响。

进一步在Poly(I:C)诱导前加入抗体,检验他们是否能够缓解异常行为和神经发育障碍,结果发现anti-IL-17 ab可以抑制母本IL-17a水平的升高,并且使后代行为和神经发育正常(图10)。这暗示着,或许可以通过抑制母本IL-17a水平的升高从而避免后代出现异常行为和神经发育障碍。

 


图10. 来源于人类的肠道微生物转移至小鼠结果分析

七、单一菌株的影响作用研究
有研究表明来源于人体的单个细菌可以促进TH17细胞的分化,本研究选择了其中四种进行分析。分别在孕第4.5、6.5、8.5天将单一菌株转移至母鼠,在孕12.5天进行Poly(I:C)诱导。结果表明单增Listeria monocytotogenes(李斯特菌)和Bacteroides fragilis(脆弱拟杆菌)定植的母本不出现TH17细胞激活,血浆IL-17a水平不升高。Bifidobacterium adolescentis(青春双歧杆菌)和Escherichia Coli CD-SpA 2A(大肠杆菌)可以激活TH17,使得IL-17a水平升高。

 



图11. 单一菌株验证实验设计和结果分析


研究结论
本文首先验证了母本肠道中SFB存在与后代行为异常和神经发育障碍的关联,并且进一步探讨了IL-17a水平升高的机理,发现促进激活TH-17细胞是关键。综合分析,后代出现行为异常和神经发育障碍有三大要素:①与诱导分化产生TH17细胞有关的细菌,②促炎刺激(Poly(I:C)),③怀孕。

亮点
本文对IL-17a水平升高的机理进行了深入探索;提出干预母本肠道菌群抑制IL-17a水平的方式,是避免后代出现异常行为和神经发育障碍的潜在方案;并且进行了人鼠模型的构建,发现女性携带促进TH17细胞分化的细菌更易在孕期发生炎症,产出神经发育障碍的后代,但有待进一步研究。

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