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科研动态

AEM:在菌株水平上检测乳制品的微生物组成结构
发布时间:2017-09-01 11:57   点击率:
导读
目前大多数常用的微生物测序手段,只能将微生物鉴定到种(species)的水平,但这往往是不够的,同一细菌、真菌或病毒往往包含很多不同菌株(strain),这些菌株编码的基因和每个基因的拷贝数可能差别很大,这种种内变异赋予不同菌株潜在的功能差异,因此不能单从菌种组成推断菌群功能,物种水平的比较分析可能无法获得样品间重要的功能差异。本研究通过16s rRNA基因测序和WGS测序分析发酵乳制品饮料nunu样本在属水平、种水平、株水平上微生物差异,发现传统加纳发酵牛奶产品nunu常被奶牛肠道相关菌群污染,由此说明了菌株水平的分析更能突出食品潜在的安全风险。
 
 
文献ID
题目:Strain-level metagenomic analysis of the fermented dairy beverage nunu highlights potential food safety risks
译名:发酵乳制品饮料nunu的菌株水平宏基因组分析突出了潜在食品安全风险
期刊:AEM
年份:2017      IF=3.807
通讯作者:Paul D. Cotter
通讯单位:爱尔兰农业与食品发展部
 
 
材料与方法
样本
发酵乳制品饮料nunu
分组信息
分两组:第一组五个样品取自接受过卫生培训的生产者(trained);第二组五个样品取自从未接受过卫生培训的生产者(untrained)。
trained:1t2am、1t6am、1t7am、1t8am、2t2am
Untrained:1u6am、2uuam、2u3am、2u6am、2u8am
测序手段及平台
16s rRNA基因测序;WGS测序
Illumina 测序平台
 
 
研究成果
1. nunu样本16s RNA基因测序属水平微生物组成
经16s RNA基因测序分析样本中微生物群落组成(图1a)。在属的水平,除1t2am中的主要优势属为乳球菌属(Lactococcus)外,其余样本优势属均为链球菌属(Streptococcus)。4/10的样品(1 trained和3 untrained)中检测到肠球菌(Enterococcus)相对丰度≥3%,且在2u6am样本中丰度最高,达到19%;葡萄球菌(Staphylococcus)在所有10个样本中均有检测到,但在每个样本中的相对丰度≤1%;9/10的样本(4 trained和5 untrained)中检测到肠杆菌属(Enterobacter)相对丰度≥1%,且在2u8am样本中丰度最高,达23%;在8/10的样本(4 trained 和4 untrained)中检测到大肠-志贺菌(Escherichia-Shigella)相对丰度≥1%,在1t7am 中丰度最高,达17%。Kruskal-Wallis 分析(图1b)显示Macrococcus(p=0.01)与Streptococcus(p=0.02)在trained与untrained样本中相对丰度存在显著差异。trained样本中Macrococcus显著高于untrained样本,trained样本中Streptococcus显著低于untrained样本。


 

图1. (A) nunu样本中属水平top25热图;(B)Kruskal-Wallis分析不同组显著性差异
 
2. nunu样本shotgun测序分析微生物种水平
基于MetaPhlAn2分析方法分析nunu样本中微生物种水平构成(图2),11个物种在所有样本中丰度达到90%以上,种水平优势微生物主要为Streptococcus infantarius,但1t2am的主要优势菌为Lactococcus lactis,4/10样本中(2 trained 和2 untrained)检测到Enterococcus faecium相对丰度≥1%,在1t2am中丰度最高,达22%。样本肠杆菌目类微生物含量也相对丰富,Enterobacter cloacaeEscherichia coliKlebsiella pneumoniae等微生物在相应的样品中检测到。Kruskal-Wallis分析显示Macrococcus caseolyticus(p=0.01)与Streptococcus infantarius(p=0.01)在trained与untrained 样本中相对丰度存在显著差异,trained样本中Macrococcus caseolyticus显著高于untrained样本,trained样本中Streptococcus infantarius显著低于untrained样本。其他物种没有相对显著差别。
 

图2. MetaPhlAn2分析方法分析nunu样本种水平微生物组成
 
3. nunu微生物潜在功能分析
基于SUPER-FOCUS方法分析nunu微生物潜在功能(图3)。在一级子系统水平下:“转位因子、噬菌体、原噬菌体”在两组样本中平均相对丰度均≥1%,但其在trained样本中显著高于其在untrained样本中含量(p=0.047)。另外,毒力因子在两组样本中平均相对丰度均≥3.5%。
 

图3. nunu样本中功能基因丰度
 
HUMAnN2方法更全面的分析nunu微生物潜在功能。25个最主要的代谢通路包括碳水化合物新陈代谢、核酸新陈代谢、蛋白质新陈代谢(图4a)。组氨酸的新陈代谢在trained样品中高于其在untrained样品中,且组氨酸脱羧酶仅在trained样品中检测到。另外,一些不良通路在两组样品中都有检测到,如腐胺生物合成和耐多粘菌素基因在7/10的样品中都有检测到,这些代谢途径都与E. cloacaeE.coliK. pneumoniae或者这三种微生物的共同作用有关(图4c)。一些耐抗生素基因如β-内酰胺酶基因和耐甲氧西林基因也在各个样本中检测到。
 

图4. HUMAnN2分析
 
4. 在株水平上分析样本中肠道微生物
MetaMLST、PanPhlAn和StrainPhlAn三种方法分析E. coliK. pneumoniae菌株水平组成(图5)。
 
MetaMLST在1t7am样本中检测到一株新的E. coli
 
StrainPhlAn检测到样本中24个E. coli marker基因,并构建了1t7am样本中E. coli菌株系统发育树(图5a),1t7am样本中E. coli菌株与E. coli O139:H28 E24377A密切相关,同时在1t7am样本中检测到ShET2肠毒素编码基因,同样的基因也在E. coli O139:H28 E24377A中发现;检测到38个K. pneumoniae marker基因,并构建了1t7am、1t8am样本与2u3am样本中K. pneumoniae菌株的系统发育树,1t8am样本与2u3am样本中K. pneumoniae菌株与K.pneumoniae KpQ3密切相关。而1t7am样本与K. pneumoniae UCICRE 7密切相关。
 
PanPhlAn检测1t7am与1t8am两个样本中E. coli菌株,显示其在功能上相差较远;PanPhlAn检测7个样本中K. pneumoniae菌株,其中5个在功能上相似(图5c),1t6am与1t7am中的两株K. pneumoniae菌株与其他相差较远。用PanPhlAn在1t2am样品中检测到TAE β-内酰胺酶基因,在2u8am中检测到OXA-48碳青霉烯酶基因,OXA-48碳青霉烯酶基因在K. pneumoniae KpQ3中也存在。
 

图5. 株水平分析
 
研究结论

通过多种方法的结合分析发现传统加纳发酵牛奶产品nunu常被奶牛肠道相关菌群污染,并在样品中检测到致病性大肠杆菌(E. coli)和肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae);短读长测序方法能够准确地从“猎枪”宏基因组数据中检测出食品中的病原菌株,短读长测序方法适合作为食品安全评估工具,可用于高通量食品安全检测。
 
亮点
本文应用16S扩增子测序与宏基因组测序方法,联用短读长分析方法MetaMLST、PanPhlAn和StrainPhlAn对传统的加纳发酵牛奶产品nunu进行风险评估,对利用高通量检测食品安全提供了一种分析思路。