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科研动态

The ISME Journal:牙周炎患者的口腔菌群特征
发布时间:2017-08-18 16:41   点击率:
导读
口腔微生物菌群是一个复杂的生态系统,已超过600种口腔微生物被鉴定。牙周炎由多种微生物共同作用而导致,近来的研究将导致牙周炎的微生物归为groups或complexes,其中“red complex”的三个物种是主要的牙周炎病原体。尽管研究者对“red complex”和牙周炎之间的关系已有很好的认识,但对这些微生物原位活动信息了解有限。本研究利用宏基因组与宏转录组,表征牙周炎患者与健康者的口腔原位基因表达模式,揭示高表达基因的功能以及高表达基因与毒力因子的相关性。

文献ID
题目:Community-wide transcriptome of the oral microbiome in subjects with and without periodontitis
译名:牙周炎患者与口腔健康者的口腔微生物群落转录组
期刊:The ISME Journal
年份:2014      IF=9.267
通讯作者:Jorge Frias-Lopez
通讯单位:美国马萨诸塞州剑桥市福赛斯研究所微生物学系

材料与方法
样本
口腔健康样本n=6(其中3个样本从口腔六个不同部位取样后混合,另3个样本只取一个部位)。
牙周炎样本n=7(其中4个样本从口腔六个不同部位取样后混合,另3个样本只取一个部位)。

样本要求
1. 身体健康,妇女未妊娠;
2. 至少三个月未使用抗生素,未接受牙周炎治疗;
3. 无其他能导致牙周炎的疾病,如糖尿病或者艾滋病。

取样方法
除去龈上菌斑,用无菌Gracey curettes取龈下菌斑,样本被放置于无菌的装有1毫升酰基苯胺的管中。

测序手段及平台
宏基因组测序,宏转录组测序,Illumina测序平台。

研究成果
1、健康样本与牙周炎样本的宏基因组与宏转录组系统发育比较
基于宏基因组与宏转录组的主成分分析,健康样本与牙周炎样本并没有明显区别,然而宏转录组中6个牙周炎样本在主成分1中集群,主成分1为主要的变异因子(图1)。


图1. 口腔健康者与口腔牙周炎患者宏基因组与宏转录组主坐标分析(PCoA)

P. GingivalisT. forsythiaT. denticola在牙周炎样本中的丰度以及基因的表达水平均高于健康样本(图2)。然而,并非所有的物种含量与其基因表达量都呈现出正相关,宏基因组结果中显示高含量的物种,宏转录组中基因并非高表达,反之亦然。如Acinetobacter baumannii在牙周炎患者中丰度显著高于其在健康供试者中的丰度,但宏转录组显示其并不是高表达;Bacteroidetes oral taxon 274、Corynebacterium matruchotiiLeptotrichia hofstadii的相对丰度较低,但在宏转录组中基因的比例却较高(图2)。“red- complex”表示两个组样品中不同的基因表达数是相似的,而且,本研究发现在数量以及毒力因子的表达量上都很重要的物种(如Corynebacterium matruchotii)也分别在两组样本中显示出相似的规律(图2)。


图2. 宏基因组与宏转录组中在数量上的相对增减

2、牙周炎与健康样本的基因表达:GO分析和KEGG代谢通路
图3a和3b分别分析了全部样本中大部分高度表达基因的基因谱以及高度差异表达基因的基因谱,尽管这两种基因谱都能将健康样本与牙周炎样本分成两组,但是高度差异表达基因能更好地区分,在牙周炎患者中不同样本的高度差异表达基因的基因谱似乎更相似,如果确实是这样,牙周炎可能是由于某些特定微生物的活动导致的。


图3. 宏转录组基因表达谱热图
a、全部样本中1212个高度表达基因的表达谱,分析之前先通过x2转化和归一化处理,根据样品归一化的总和选择最高表达的基因;b、全部样本中1000个高度差异表达基因的表达谱,从NOISeq结果中选择基因,并在分析前先通过x2转化。红色表示健康样本,绿色表示牙周炎样本。
 

GO分析显示,牙周炎样本中鞭毛运动、多肽运输、铁捕获相关的生物过程以及酰胺降解过度表达,脂质A的生物合成是革兰氏阳性菌内毒素的一个组成部分(图4a和b),牙周炎样本中钾运输、多糖合成生物过程未充分表达。基于KEGG通路的基因集富集分析显示过度表达途径与广泛活动有关,如能量代谢(氨酰-tRNA生物合成、氮代谢),碳水化合物代谢(糖酵解/糖质新生、柠檬酸循环、丙酮酸),细菌运动性和趋化性以及与电子传递(例如光合作用、卟啉、叶绿素新陈代谢)相关的基因。占KEGG通路大部分的生物合成次级代谢产物、抗生素、萜类化合物、生物碱以及脂类的代谢在牙周炎样本未充分表达。

图4 REVIGO散点图可视化GO富集分析概括
a、 牙周炎样本中与生物过程相关的GO terms;b、健康样本中与生物过程相关的GO terms;c、牙周炎样本中与分子功能相关的GO terms;d、健康样本中与分子功能相关的GO terms。
圆圈表示GO terms,并根据相似度来绘制(邻近的圆圈表示紧密相关),圆圈大小与GO terms的频率成正比,而颜色则表示log10 P值(红色高,蓝色低)。


3、主要牙周炎病原体中假定毒力因子的表达谱
“red complex”中的P. GingivalisT. forsythiaT. denticola高表达金属蛋白酶与肽酶,以及牙周炎病原体中参与铁代谢的蛋白的假定毒力因子表达上调。其中包括铁转运蛋白B、铁化合物ABC ATP结合蛋白转运体、铁肠杆菌素运输ATP结合蛋白FepC、铁螯合吸收ABC转运蛋白FeCT透膜酶蛋白。与健康样本相比,牙周炎样本P. gingivalis溶血素基因表达含量更高,P. gingivalisT. denticola基因参与维生素B12输入(维生素B12 ABC转运体透性酶成分成分BtuC)。

牙周炎样本也有不直接参与铁代谢但编码其他蛋白质的高表达基因,如ATP-dependent Clp蛋白、ATP-结合亚单位ClpA、分子伴侣ClpB蛋白、GroEL、RNA聚合酶因子RpoD。

宏转录组分析发现,牙周炎样本中T. denticola大部分需要合成鞭毛的基因都是高表达的,其中包括鞭毛基体FlgC、FlgF和FlgG,鞭毛钩蛋白质FlgE和FlgK,鞭毛马达旋转蛋白MotA和MotB,鞭毛运动开关蛋白质FliG和FliM,鞭毛蛋白FlaA,鞭毛M环蛋白FliF,鞭毛特异性ATP合酶-FliI和参与鞭毛合成的蛋白质(FleN、flha-b、FlhF和FliP。3个主要的牙周炎病原体中,只有T. denticola过表达了与寡肽运输(OppA、OppD和OppF)有关的蛋白。

4、口腔中假定毒力因子表达和毒力因子相关基因
牙周炎样品中来自于255个物种的7846个毒力因子为基因高表达,尽管有64个物种的毒力因子超多40个,牙周炎样本中的“red-complex”的物种以及一种与局部青少年牙周炎有关的微生物Aggregatibacter actinomycetemcomitans高表达了大量的毒性因子(图5)。然而,令人惊讶的是一些被报道只与其他疾病相关的微生物,如Neisseria spp.Corynebacterium matruchotii、Rothia dentocariosa、Veillonella parvula、Actinomyces spp等也过度表达了大量的毒力因子,这在疾病的演化过程中非常重要(图5)。
 

图5. 宏转录组中上调毒力因子数量
数字是不同物种的假定毒性因子绝对数。红色表示“red-complex”的组成

牙周炎样品中的大量物种的高表达基因存在其他途径,包括:氧化应激耐受性(触发因子、超氧化物歧化酶、烷基过氧化氢还原酶C蛋白AhpC);特殊调节性蛋白(如磷酸盐调节子转录调控蛋白PhoB SphR、RNA聚合酶起始因子RpoD / RpoD、翻译延长因子Tu);特殊蛋白运输体统(如辛ABC转运体ZnuA、ZnuC,ABC型多药运输系统ATP酶,透性酶组分);寡肽 ABC转运体;硝酸还原酶蛋白(α亚基、β亚基、δ亚基、γ亚基);丝氨酸蛋白酶(MucD /AlgY、DegP/HtrA);溶血素;大量参与鞭毛生物合成有关的蛋白质(如FlaA-B、FlaG、FleN、FlgB-I、FlgK-L、FlhAB、FlhF、FliD-I、FliK-N、FliP-S、MotA 和 MotB);分子伴侣(如GroEL)。表达了大量毒性因子的微生物对ABC转运体高表达,而ABC转运体对抗癌药物道诺霉素(DrrA)表现出耐药性。

研究结论
铁的获取、脂多糖合成和鞭毛合成等功能模块在牙周炎微生物组中上调,这些功能的上调由多种致病菌导致;牙周炎中多种毒力因子显著上调,一些被报道只与其他疾病相关的微生物,如Neisseria spp.Corynebacterium matruchotii、Rothia dentocariosa、Veillonella parvula、Actinomyces spp等也过度表达了大量的毒力因子,预示着这些微生物在疾病的演化过程中非常重要。

亮点
本研究利用宏基因组与宏转录组两种方法探讨了牙周炎中基因的表达,以及其在牙周炎中所扮演的角色,有助于我们了解牙周炎微生物活动,为对今后牙周炎的治疗提供了参考。