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技术课堂

不是哆啦A梦,也能从口袋里掏出测序仪
发布时间:2017-12-14 10:50   点击率:
从一代Sanger测序,到二代454、solid和illumina测序及三代Pacbio测序,这些年测序技术迅猛发展,使基因组研究的成本大大降低。各种测序平台更新面市,呈现出百家齐放的昌盛景象。今天我们介绍一位测序行业的新面孔-“Nanopore”-基于纳米孔的第四代测序技术。

目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪。它的特点是体积小,方便携带,测序读长长(超过300kb),测序速度快,测序数据实时监控等。
庐山真面目
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如此小巧的它,是怎么展开测序的呢?
请看工作原理&测序过程。

 
  工作原理

Nanopore测序的核心部件是由蛋白质构成的纳米级小孔,称之为“Pore”。这个蛋白质插在电阻膜中。薄膜的两侧浸没在含有离子的水溶液当中。在薄膜的两侧加上电压,离子就会通过蛋白质小孔,从膜的一侧移动到膜的另一侧,从而产生电流(工作原理如下图所示)。

测序过程中,当DNA单链通过这个小孔,就会对离子的流动造成阻碍。
 

碱基ATCG由于分子结构不同,因此对电流的影响不同。这些被记录下来的电流波动信号,经过分析,即可获知通过小孔的碱基。
 

测序芯片的核心是形成pore的那个蛋白,称之为“Reader”。这个蛋白是天然的能插入到底物中的跨膜蛋白,经基因改造获得。目前R9版芯片是一个来自于大肠杆菌中名为“CsgG”的蛋白。

 
  测序过程

MinION测序仪的芯片上有2048个纳米孔,孔中装有穿膜的蛋白,分成512组,构成专用集成电路控制的flow cell。
 


以2D文库为例,建库时,将双链DNA片段两端连接接头(lead adaptor,hairpin adaptor和trailing adaptor)。测序开始,lead adaptor含有动力蛋白(DNA解旋酶),带领测序分子进入由酶控制的纳米孔,lead adaptor后是待测DNA链通过纳米孔,hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证,然后待测序分子的互补链通过纳米孔,最后是trailing adaptor通过。(图a)

在上述测序方法中,待测DNA链和待测链的互补链依次通过纳米孔,利用pairwise alignment,它们组合成2D read;而在另外一种测序方法中,不使用hairpin adaptor,只测序template read,最终形成1D read。所谓1D,是指建出来的库,正义链与反义链是完全分离开的,在测序的时候是分别被单独测序的。1D测序方法通量更高,但是测序准确性低于2D read。

目前,Nanopore公司开发出了1D^2文库试剂盒,也可以让第二链紧跟着第一链被测序。

 
(a.DNA 进入pore测序的过程;b.DNA通过pore时的实时电流;C.放大版的电流信号)

 
  Nanopore家族成员

根据通量不同,Nanopore公司开发了几种测序仪。
 
1、MinION(小型)
 
只能承载1张芯片;MinION的尺寸之小,只有一支笔的长度,重大约100克,MinION完全颠覆了测序仪的形象,MinION直接通过USB链接到笔记本上,进行数据读取。


2、GridIONx5(中型)

它可以一次承载5张芯片。


3、PromethION(大型)

一次可以承载48张芯片。
中型和大型机器的每个芯片可以同时单独工作。


4、SmidgION(迷你新产品)

最近,Oxford Nanopore Technologies还推出了一款比MinION更加迷你的SmidgION,这款仪器可与手机连接使用,更加便携,可在各种环境中使用。

 

平台优势
 
1. 不需要PCR扩增和化学修饰
2. 直接进行碱基修饰的检测
3. 实时测序监控
4. 测序读长增加
5. 结构变异的检测
6. RNA表达分析

参考文献:
1: Lu H, Giordano F, Ning Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2016 Oct;14(5):265-279. doi: 10.1016/j.gpb.2016.05.004. Epub 2016 Sep 17. Review
2.1: Jain M, Olsen HE, Paten B, Akeson M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biol. 2016 Nov 25;17(1):239. Erratum in: Genome Biol. 2016 Dec 13;17 (1):256.
公众号:陈魏学基因;生信者言

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