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研究方案还没定?“肠道菌群与疾病的分析思路”给你灵感
发布时间:2017-12-07 18:38   点击率:
近年来,肠道菌群的研究异常火爆,特别是关注疾病研究的朋友们,每周都会在Science、Nature、Cell或者别的顶级学术期刊上发现几篇肠道菌群与疾病相关的文献,时刻刷新着我们对肠道菌群的认知,肠道菌群的作用真可谓是只有我们想不到,没有它们做不到的。那么,该如何进行深度分析挖掘,才能比较彻底地了解肠道菌群与疾病的“爱恨情仇”。小锐最近看相关的文献比较多,在此给大家分享一下肠道菌群与疾病相关的分析思路。
 
先上一张总结图,包您一目了然、满脑思路、满心喜悦。

 
 1、疾病患者肠道菌群的特征 

比对物种数据库,得到物种丰度表,简单描述门、纲、目、科、属、种各个水平上物种丰度组成,一般描述优势物种的组成情况。当然也可以通过CAG、MGS等算法,获取菌株水平上的丰度信息。

图1. 哈扎狩猎者和印度人门水平上优势物种分布[1]

 
 2、研究菌群是否是引发疾病的因素 

一般使用小鼠模型进行菌群移植,分为同笼饲养和无菌小鼠灌胃、灌肠等移植方式。

2.1 同笼饲养
同笼饲养小鼠时,小鼠的食粪习性可以实现肠道菌群的移植。Buffington等为了证明自闭症与肠道菌群有关,首先用小鼠模型研究了高脂饲喂的孕期小鼠后代容易表现出自闭症的症状,并且其肠道菌群的组成与正常饮食饲喂的孕期小鼠后代不同。继而对高脂饲喂、正常饮食饲喂的孕期小鼠后代使用同笼饲养的方式,实现不同饮食模式小鼠的菌群移植,结果发现同笼饲养的高脂孕期小鼠后代的肠道菌群发生了变化,菌群组成与正常饮食孕期小鼠后代的更相近(图2)[2]。

 

图2. 同笼饲养小鼠肠道菌群组成的PCA分析
紫色代表正常饮食孕期小鼠后代;蓝色代表同笼饲养的正常饮食孕期小鼠后代;红色代表高脂饮食孕期小鼠后代;黄色代表同笼饲养的高脂饮食孕期小鼠后代。

2.2 无菌小鼠移植
无菌小鼠灌胃、灌肠等菌群移植的方式是最常采用的菌群移植方法。Buffington等研究无菌小鼠和正常小鼠时,发现无菌小鼠出现自闭症的行为特征,因此猜想菌群是否是影响自闭症的原因呢。接着将正常饮食孕期小鼠的后代和高脂饮食孕期小鼠的后代的肠道菌群移植到无菌小鼠内,发现移植高脂饮食孕期小鼠后代肠道菌群的无菌小鼠行为不正常,菌群组成与移植正常饮食孕期小鼠后代的无菌小鼠的组成不同。


 
图3. 第四周和第八周移植正常饮食孕期小鼠后代肠道菌群(蓝色)和移植高脂饮食孕期小鼠后代肠道菌群(红色)的无菌小鼠肠道菌群组成的PCA分析

联用两种方法来研究菌群是否为引发疾病的因素,无疑给这篇文献增加了亮点。

 
 3、找到疾病相关的biomarkers 

利用差异分析方法,找到疾病组和健康组显著差异的微生物,使用差异的微生物构建疾病监测模型,或者可以验证该差异物种是否是引起疾病的因素。

3.1 构建疾病监测模型
Bedarf等研究帕金森患者和健康人肠道菌群上的功能差异时,发现了6种差异的KEGG modules,为了确定哪种微生物在帕金森病中起关键作用,文章将基因进行了物种注释,发现微生物Eubacterium在帕金森患者中显著升高,用Eubacterium构建帕金森患者的疾病监测模型,AUC达到63%,合并其它五种差异微生物构建帕金森患者的疾病监测模型,AUC达到84%[3]。


图4. 帕金森患者疾病监测模型

锐翌基因与浙江中医药大学合作项目使用宏基因组研究强直性脊柱炎(AS)患者肠道菌群,使用3种方法挑选AS疾病的biomarkers,分别是33个物种markers、30个基因markers和62个clusters makers,构建AS疾病诊断的分类模型,在验证组中三种方法构建的AS分类模型的AUC分别为93.55%、96.64%和92.61%[4]。


图5. 强直性脊柱炎(AS)患者疾病监测模型

用biomarkers构建疾病监测模型的文献,都不是低分的文章,你的文章中是否也需要该方法锦上添花呢?


3.2 验证biomarkers是否是引起疾病的原因
3.2.1 分离菌株,使用菌群移植的方式在模式小鼠中进行验证。

Buffington等比较高脂饮食孕期小鼠后代与正常饮食孕期小鼠后代的肠道菌群,发现Lactobacillus reuteri(罗伊氏乳杆菌)在正常饮食孕期小鼠后代中丰度显著高于高脂饮食孕期小鼠后代,假设该菌是引起高脂饮食孕期小鼠后代社会行为障碍的原因。给4周的高脂饮食孕期小鼠后代饲喂罗伊氏乳杆菌后,检测小鼠的社会行为,发现其可以明显改善后代自闭症症状。并且从催产素水平和神经元活性深入研究探讨了罗伊氏乳杆菌改变小鼠的社会行为的机制[2]。


 

图6. 罗伊氏乳杆菌移植实验及移植后小鼠社会行为检测

3.2.2 基于宏基因组基因组装,组装菌株。
Heintz‐Buschart等使用16S测序比较健康人与疾病组时,,发现10个显著差异的OTUs没有物种注释信息,继而使用宏基因组数据组装其基因组,进行功能挖掘。对OTU_469和OTU_171(均在PD患者中丰度低)进行基因组组装,结果发现OTU_171属于Cyanobacteria门Melainabacteria科,Cyanobacteria可以产生神经毒素,与神经性疾病相关。OTU_171菌株与同一种水平的产毒素菌株竞争,具有保护性作用;OTU_469菌株与aSyn相似,具有保护性作用,阐明帕金森患病的机制[5]。


 

图7. 差异物种基因组组装


小锐总结的这些研究思路,都频繁地出现在高影响因子的文章中。希望它们给您带来灵感,助力深入挖掘肠道微生物与疾病之间的关系。


参考文献:
[1] Schnorr S L, Candela M, Rampelli S, et al. Gut microbiome of the Hadza hunter-gatherers.[J]. Nature Communications, 2014, 5(3654):3654.
[2] Buffington S A, Di P G, Auchtung T A, et al. Microbial Reconstitution Reverses Maternal Diet-Induced Social and Synaptic Deficits in Offspring.[J]. Cell, 2016, 165(7):1762.
[3] Bedarf J R, Hildebrand F, Coelho L P, et al. Functional implications of microbial and viral gut metagenome changes in early stage L-DOPA-naïve Parkinson’s disease patients[J]. Genome Medicine, 2017, 9(1):61.
[4] Wen C, Zhang Z, Shao T, et al. Quantitative metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis[J]. Genome Biology, 2017, 18(1): 142.
[5] Heintz‐Buschart A, Pandey U, Wicke T, et al. The nasal and gut microbiome in Parkinson's disease and idiopathic rapid eye movement sleep behavior disorder[J]. Movement Disorders Official Journal of the Movement Disorder Society, 2017.

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