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热门技术 | 目标序列捕获测序,低丰度大样本量研究的省钱王道
发布时间:2017-11-09 18:08   点击率:
目标序列捕获测序是将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针,与基因组DNA在序列捕获芯片(或溶液)进行杂交,然后把目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用测序技术进行研究的策略。该项技术具有高度灵活性、特异性、及操作便捷等特点。

 
 1. 目标序列捕获简介 
根据杂交时状态的不同,目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。

固相杂交法所用的探针通常都是固定在固体支持物上,如玻璃片、塑料球等,其中最典型的是基因芯片。固相捕获系统构建首先选定目标DNA区域,在修饰了的玻璃片基础上原位合成一系列与目标区域互补的探针。通常,基因芯片是杂交后,洗脱未杂交上的DNA片段,然后扫描成像获取每个探针的杂交信号;而固相杂交捕获则只有最后一步不同,即与探针杂交的DNA被洗脱下来,用于后续的测序工作。

液相杂交与固相杂交最大的差异在于杂交反应的环境不同。液相杂交是在溶液中,目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交,然后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA,洗脱后,富集的DNA用于测序。


 
 2. 目标区域捕获平台 
现在常用的目标区域捕获平台包括 NimbleGen 和 Agilent 两种,他们都已成功应用于目标区域的捕获,并提供这一方法的商业化试剂盒。

NimbleGen芯片序列捕获技术
2008年,罗氏公司推出革命性的NimbleGen序列捕获芯片,其原理即核酸分子杂交,依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段为探针,检测样品中哪些核酸序列与其互补,然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。

NimbleGen序列捕获方法
此法为固相杂交。液相杂交在下文的Agilent SureSelect序列捕获中介绍。

①基因组片段化及末端补平:基因组超声或雾化为小片段,并通过末端补平,制备大小约500bp的平头末端片段文库。
②接头连接:将接头连接至文库片段,以提供引物结合位点,用于后续洗脱片段文库的富集扩增反应。
③杂交:将片段混合物变性,在用于捕获基因目的区域的NimbleGen序列捕获芯片进行杂交。
④芯片洗脱:杂交之后,洗脱未结合的片段。
⑤目的片段洗脱:将芯片移入NimbleGen洗脱系统,洗脱回收所富集的核酸片段。
⑥扩增:扩增富集片段。
⑦富集水平检测:通过qPCR质量检测并比较富集扩增的核算片段与未富集扩增的片段从而验证对照位点的富集程度。
⑧制备测序DNA:富集扩增的目标DNA混合产物可以直接用于高通量测序分析。

NimbleGen序列捕获的相关产品

Agilent SureSelect靶向序列捕获系统
2009年,安捷伦科技公司推出Agilent SureSelect目标富集系统,基于安捷伦卓越的寡核苷酸合成技术的靶向序列捕获系统,是一个适用于多种规模测序研究项目的可缩放平台,利用SureSelect平台,研究人员可仅对感兴趣的区域进行捕获。

SureSelect靶向序列捕获系统可以显著降低二代测序技术(next-generation sequencing)的成本,并且可以极大程度地提高测序效率。在此我们主要以SureSelect液相捕获系统进行说明。

Agilent SureSelect序列捕获系统方法(液相杂交)
①基因组片段化及末端修复:基因组超声或雾化为小片段,并通过末端补平,制备平头末端片段文库。
②杂交:样本文库在杂交缓冲液中进行杂交,将样品与生物素化的RNA探针组进行杂交。
③磁力捕获:链霉亲和素包被的磁珠捕获杂交的目的DNA片段并分离纯化,除去未结合的DNA片段。
④扩增纯化:PCR扩增捕获的DNA片段并纯化PCR产物。
⑤制备测序DNA:富集扩增的目标DNA混合产物可以直接用于高通量测序分析。
如图所示,SureSelect液相靶向序列捕获系统操作流程非常简单,绝大多数步骤都在微型离心管或者微孔板中进行,目前已经可以和Illumina公司的基因组测序仪完美联用。依托于安捷伦的免费在线设计平台eArray(http://earray.chem.agilent.com/eArray), 客户可以灵活定制最适合自身需求的序列捕获系统。

液相杂交与固相杂交相比有两大优势:
第一、杂交效率更高;
第二、易于操作,时间短,便于自动化操作。

Agilent SureSelect序列捕获的相关产品

安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统
安捷伦的SureSelect靶向序列捕获系统可以显著降低下一代测序技术(next-generation sequencing)的成本,并且可以极大程度的提高测序效率。

SureSelect人全外显子50Mb序列捕获试剂盒
该新型试剂盒是安捷伦科技与维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)和 Gencode 研究团队合作开发而成,科学家们为原有的 Agilent SureSelect 人全外显子试剂盒增加了 12 兆碱基(Mb)的新内容,使覆盖碱基总数达到约 50 Mb。

安捷伦SureSelect激酶组靶向序列捕获试剂盒
这种由荷兰癌症研究所Antoni van Leeuwenhoek医院的Rene Bernards博士开发的新型分析试剂盒,能够特异性地捕获500余种已知激酶基因以及一些癌症基因和非翻译区。


 
 3. 目标序列捕获技术应用 
在医学研究中的应用
目标序列捕获实验的主要用途之一是研究导致疾病发生的遗传变异。

对于单基因遗传疾病,传统的正向遗传手段是通过家系连锁分析。它要求有足够的分子标记,当然自从SNP芯片出现后此问题得到极大的缓解。传统方法还有一个缺点是要求研究的家系有足够多的交换(至少三代),但是由于患病家系个体的寿命短或者子一代到一定年龄后才发病,导致大量家系只能收集到两代人的样本。

而用捕获测序来研究这些案例就可以解决这个问题,因为它只需要核心家系就可以了。还有一些遗传病在表型上非常相似,但可能是目前已知基因变异的一种,这样我们也可以把这些变异区域并在一起,设计目标序列探针并捕获测序,这比传统的PCR后毛细管测序通量高,速度快,深度深。

其他方面的应用
目标序列捕获技术在生物进化的研究中也起着重要的作用。
例如,在研究古代尼安德特人的基因组中。由于尼安德特人已经灭绝已经有几万年,遗留下来的只有骨骼,DNA已经严重降解。这些DNA和新鲜样本的DNA比,处理非常困难,同时还存在着非常严重的微生物基因组污染,因此这种样品是不适合用鸟枪法测序的。

研究人员运用目标序列捕获技术对尼安德特人基因组中有关人类进化相关的基因进行富集,富集率高达190,000倍,这样就获得了尼安德特人序列中几乎所有感兴趣的位点。此项研究过程中建立的方法学可应用于考古学、古生物学乃至人体法医学等领域中,比如恐龙基因组的研究等。


安捷伦公司推出了SureSelect RNA捕获试剂盒,利用此技术富集感兴趣基因的RNA,通过对这些基因的有效富集,研究人员不需要增加测序总量就可以检测低丰度基因,同时他们还检测到了基因融合。利用RNA捕获测序技术可研究许多问题,如低丰度转录本的定量,基因的可变剪切,基因融合以及等位基因的表达。



 
 4. 目标序列捕获技术优势 
① 检测区域明确:只需对基因组中感兴趣的候选区域进行测序就可满足研究需求。
② 成本低:大幅缩小测序区域,极大地降低了成本,非常适合大样本量研究。
③精确:通过目标区域测序,可以对候选位点或候选基因进行验证;也可以进一步找到候选区域或候选基因内的易感位点。


 
 总结 
目标序列捕获测序是目前基因组学研究中的一个热点技术,主要原因是全基因组测序需要耗费大量的成本和时间。所以有选择性(目标序列捕获)的深度测序是目前基因组研究的明智选择。当人们只对部分基因组进行测序时,在相同成本下,研究者可以研究到更多的样本数量和测到更深的深度。特别对于一些稀有的变异或者部分体细胞的基因突变,测序深度决定了靶向测序是一种有效的工具。

靶向测序作为全基因组测序的补充技术是非常有用的,它大大简化了分析的目标。该技术已被证明是一个强大、有效的技术,并在新一代高通量测序中发挥独特之处,已经产生了许多令人兴奋的新发现,应用领域也越来越广泛。