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长篇干货 | 这些文库质检仪器,你必须知道
发布时间:2017-09-22 17:00   点击率:
高通量测序技术是测序史上一次革命性的改变,可以一次性对几十万~几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中被称为下一代测序技术(next generation sequencing),足见其划时代的意义。同时,高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

文库质检是高通量测序的关键步骤,它关系到测序的数据产量,直接影响成本,重要性不言而喻。因此为了提高测序准确性、减少测序过程中的风险,测序前需要测定文库样品的浓度和片段大小分布,确定合适的上机pooling方案。

常规检测包括两方面,文库的浓度检测和片段大小检测。接下来,小锐带大家认识一下文库质检中的常用仪器,以及它们的原理、优缺点。

 
 文库浓度检测 
 
1. NanoDrop分光光度计
 

NanoDrop及其它紫外分光光度计,均利用紫外吸光度进行检测。

紫外吸收法检测原理:核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统,能吸收紫外光,RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处,根据光吸收值可以计算核酸的含量。A260显示的是10mm光程下的260nm处的吸光值。A280则显示10mm光程下的280nm处的吸光值。

260/280是260nm和280nm处的吸光值的比值,这个值用来判定DNA和RNA的纯度。纯DNA的比值在1.8左右,纯RNA的比值在2.0左右。如果这个比值偏小,表明有蛋白、苯酚或者其他污染物存在,因为这些物质在280nm处有明显的光吸收。

260/230指260nm和230nm处的吸光值的比值,这是一个次要的核酸浓度指示值。纯核酸的这个比值比260/280比值大,一般在1.8-2.2之间,如果比值偏低,表示核酸中有污染物。

利用NanoDrop检测文库样品,其检测极限为2 ng/ul(dsDNA),检测的浓度为质量浓度。

此法操作简便,迅速,但缺点是无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。

 

2. Qubit荧光计
 
Qubit是新一代核酸和蛋白定量仪,采用荧光染料检测特定目标分子的浓度,能够对DNA和RNA进行精准定量。在Qubit测定中,每种染料都适用于一种分子:DNA,RNA或蛋白质。这些染料原本只能发出非常弱的荧光,直到它们与靶标(DNA,RNA或蛋白质)结合后,它们才能发出强烈荧光。染料在结合靶标前后的荧光信号强度相差数个数量级。
例如,用于高灵敏度(high sensitivity)测定的Qubit DNA染料在未结合DNA时,只具有极低的荧光。当结合DNA时,可能通过基底之间的嵌入,它呈现更刚性的形状并发出强烈荧光。并且结合过程很快,一旦添加到DNA溶液中,Qubit DNA染料可在几秒钟内与DNA结合,并不到两分钟就达到平衡。

在特定量的染料中,来自该混合物的荧光信号的量与溶液中DNA的浓度成正比。Qubit荧光计可以获取该荧光信号,并使用已知浓度的DNA标准品将其转化为DNA浓度。 Qubit荧光计使用DNA标准品来得出DNA浓度与荧光的关系。然后使用这种关系根据其与Qubit染料混合时的荧光来计算样品的浓度。

 

荧光染料法采用MolecularProbes® 染料,该荧光染料只有与特异性的靶分子(DNA、RNA或蛋白质)结合时,才能发出荧光信号,但游离核苷酸或降解核酸存在时也可以被检测到。

利用Qubit荧光计high sensitivity检测方法的范围为10 pg/ul - 100 ng/ul  (dsDNA),检测的浓度为质量浓度。

Qubit技术只检测靶分子的浓度,这种特异性可以获得十分精确的结果。这对后续的精确建库过程是很必要的,可以作为后续测序定量的参考。


 
3. 实时荧光定量PCR
 
实时荧光定量PCR技术(qPCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。

LightCycler® 480 仪器是一种具有实时在线检测能力的快速热循环仪器。安装后能实施单相PCR,即同时扩增和检测靶核酸。通过加入双链DNA特异性荧光染料或荧光基团标记的序列特异性寡核苷酸探针,来检测靶核酸。这两种途径都能在扩增时测量PCR产物,以此作为定量PCR的基础。通过分析熔解曲线的方式分析PCR后得到的产物,可用于PCR产物鉴定或基因突变检测(即单核苷酸多态性)。

二代测序的DNA文库构建中有两个步骤会影响测序数据量。
一个步骤是插入片段与通用接头的连接,由此导致最后得到的文库中往往残留有一定数量的各种不完整连接产物,比如插入片段的一端有接头、另一端没有接头;插入片段两端都没有接头;两个接头自连、中间没有插入片段;游离的接头和插入片段等等。
另一个步骤是PCR,由此导致多余的引物形成引物二聚体。
如果我们把这些“杂质”都当成文库加入到flowcell中,一方面有效浓度低,导致簇密度下降;另一方面任何带有接头的杂质都会与flowcell上的接头进行分子杂交,占据相应的空间,但是不能生成正常的簇,浪费flowcell空间。二者都会导致测序数据量少于预期。

用定量PCR进行文库质检,可以在一定程度上解决这个问题,提高flowcell的利用效率。即使我们不对文库进行纯化去除这些“杂质”,按照定量PCR的结果上样,也相当于上样浓度提高了。上样浓度越高,flowcell内结构完整的文库分子就越多,它们与杂质分子竞争,与flowcell上的接头杂交成功的概率就越高。

Illumina文库上机测序前会先进行桥式PCR扩增反应,文库测序时的状态其实是扩增后的状态;而以P5和P7(Illumina文库两侧接头)引物做qPCR,其扩增后的产物状态和文库测序时的状态(桥式PCR扩增反应后)是最接近的。因此,以qPCR检测结果做测序上机定量是非常准确的,这也是为什么我们采用此方法来检测文库浓度的原因。

LightCycler® 480 绝对定量法检测文库的摩尔浓度。

 
 文库浓度检测方法比较 
 
 
 文库片段大小检测 
 
1. 琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时受电荷效应和分子筛效应的影响,当DNA分子在高于等电点的pH溶液中时会带负电荷,在电场中向正极移动 。DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。

琼脂糖凝胶电泳能够获得文库的片段大小范围,但不能确定文库片段大小的精确分布,灵敏度低,且无法检测含量较低的小片段和大片段,检测繁琐费时,效率低下。


 
2. 微流控芯片技术
 
Agilent 2100 Bioanalyzer检测是对文库进行定性以及定量的新一代测序质控。定性,即判断文库构建是否成功;而定量,有别于qPCR并作为qPCR的参照为上机提供参考。

Agilent 2100 Bioanalyzer是基于芯片的实验室技术的核酸分析系统,通过微流体技术对样品进行分离。当给芯片加入电压时,样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳,在样品流动过程中,不同DNA片段根据其大小被分离。凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入到DNA双链,通过激光激发荧光,使其被仪器检测到,仪器根据收集到的荧光信号强度对样品进行定量。

微流控芯片技术通过芯片电泳的方式提高平板电泳质量,对文库每一个片段的大小进行精确测定,可对文库进行定性和定量,判断文库构建是否成功。文库测定时可根据需求,选择不同灵敏度芯片。

Agilent 2100 Bioanalyzer芯片检测范围

 
 文库片段大小检测方法比较 

影响测序结果的因素有很多,包括文库的质量、文库的上机定量、测序仪的状态等,所以文库质检是不可或缺的,对文库浓度及片段大小的准确检测以达到测序仪的上机要求是测序工作前必要的环节,是保证测序结果准确的前提。