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方案设计与研究思路总结,助您开启“疾病与肠道菌群”研究
发布时间:2017-05-04 14:55   点击率:
毫不夸张的讲,近年来几乎每天都有与疾病相关的肠道微生物研究文章发表在各大顶级期刊上,肠道微生物与肥胖、帕金森、抑郁症等疾病的关系也不断刷新着研究者的视觉,貌似多种类型的疾病都与肠道菌群的变化有关。那么如果您想发表一篇高影响力的疾病与肠道菌群相关的文章,应该如何设计实验,如何分析数据才能抓住审稿人的眼球,在众多投稿中脱颖而出?小锐总结归纳了与疾病相关的微生物研究文献的实验设计方法及研究思路,抛砖引玉,希望对您的科研工作有所帮助。
 

1、疾病患者与健康人肠道微生物的差异

 

实验设计

将研究群体分为健康人和患某种病的病人,设置实验组和验证组,实验组中健康人和病人的生物学重复数远高于验证组。取其粪便进行微生物多样性或宏基因组测序分析。

 

研究思路

比较分析健康人和患者的肠道微生物菌群的差异;实验组中基于健康人和患者的差异微生物,寻找疾病相关的marker,构建疾病检测模型;使用验证组中样本,对实验组中建立的疾病检测模型进行验证判定。

 

经典案例
 Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control [Nature, 2013]
收集53名Ⅱ型糖尿病患者、49名糖尿病耐受损伤和43名正常欧洲妇女的粪便微生物进行宏基因组测序,进行微生物组成和功能组成分析,建立判别T2D的模型,将模型应用于糖尿病耐受损伤的妇女中,结果显示此模型可以将糖尿病耐受损伤的妇女中可能患T2D的人区分出来,鉴定为T2D患者的甘油三酯和C肽浓度较高。

 
▲ 区分Ⅱ型糖尿病的微生物丰度和MGCs
 
▲ Ⅱ型糖尿病IGT模型判定结果

2、疾病发展过程中肠道微生物的变化

 

实验设计

按疾病发展的重要阶段取样,如健康人、腺瘤患者、癌症患者。取其粪便进行微生物多样性或宏基因组测序分析。

 

研究思路

比较分析疾病发展过程中肠道微生物的变化,寻找疾病发生进程相关的marker;后续可以通过调控疾病发生进程中相关的marker或者通过手术去除腺瘤等手段,有效地预防疾病的发生。

 

经典案例
 Gut microbiome development along the colorectal adenoma–carcinoma sequence[Nature Communications, 2015]
收集44位腺瘤患者、46位结直肠癌患者及57位健康人的粪便样品,进行宏基因组测序,差异分析比较发现130,715个基因Markers,得到126个相关宏基因组连锁群(MLG Markers),通过随机森林的方法找到了15个MLG可以区分健康人与结直肠癌患者的分类器。功能研究发现结直肠癌患者的氨基酸发酵或胆汁酸代谢产生致癌物质,产短链脂肪酸功能下降。

 
▲ 健康人、腺瘤患者和结直肠癌患者肠道MLG之间的相关性分析
 

3、疾病治疗(药物干预、饮食干预、粪菌移植)对肠道微生物的影响

 

3.1 以患者为研究对象 

实验设计

将研究对象分为健康人、疾病患者和给药患者,其中可以根据药物浓度或结合临床指标取药物治疗过程中关键的时间点对给药患者进行分组,收集相应的粪便进行微生物多样性或宏基因组测序分析。

 

研究思路

比较分析不同药物浓度或药物干预过程中各群体肠道微生物组成的变化,分析疾病发生发展过程人体微生物和疾病的相互关系,发现和疾病发生具有因果关系的物种、基因或功能,对疾病的治愈有指导性作用。

 

经典案例
 Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota [Nature, 2015]
分析来自丹麦、瑞典和中国的106个Ⅱ型糖尿病患者、93个二甲双胍给药患者和554个健康人的肠道菌群,结果发现二甲双胍改变Ⅱ型糖尿病患者的菌群,提升了细菌生成某些类型短链脂肪酸(如丁酸、丙酸)的能力,短链脂肪酸合成可能通过刺激肠道糖异生,增加机体胰岛素敏感性,促进二甲双胍的治疗效果;此外二甲双胍的某些副作用可能也跟肠道菌群相关。

 
▲ 二甲双胍对肠道微生物的影响
 
3.2 模式动物
实验设计

选取月龄相同、体重相近、性别相同的小鼠,随机将小鼠分为健康组、造模组、造模给药组(根据给药不同浓度分组)、阳性对照组,收集小鼠粪便进行微生物多样性或宏基因组测序分析。

备注:造模组必须有一定的临床指标或者是现象可以表明造模成功。

 

研究思路

比较分析不同药物浓度或药物干预过程中各群体肠道微生物组成的变化,分析疾病发生发展过程中微生物和疾病的相互关系,发现和疾病发生具有因果关系的物种、基因或功能,对疾病的研究具有指导性作用。

 

经典案例
Ganoderma lucidum reduces obesity in mice by modulating the composition of the gut microbiota[Nature Communications, 2015]
收集正常饮食、正常饮食与喂食8%灵芝菌丝提取液、高脂饮食、高脂饮食组与喂食不同浓度灵芝菌丝提取液(2%、4%和8%)的小鼠粪便进行微生物多样性测序分析,研究发现高脂诱导的肥胖小鼠进行了药物处理之后,肥胖小鼠体重下降,炎症改善,胰岛素敏感性增加,小鼠的肠道菌群生态紊乱也得到了逆转,此外小鼠肠屏障的完整度得以维持,还降低了代谢性内毒素血症的水平。

 
▲ 灵芝治疗的Ⅱ型糖尿病患者肠道菌群的变化
 
more tips
研究肠道微生物与疾病的关系时,群体选择非常重要,不同个体微生物组成差异较大,因此可以选择大量样本进行研究,减少个体差异较大对结果的影响,或者是严格控制年龄、体重、性别等外在因素对微生物组成的影响。

如果研究某种疾病对肠道菌群的影响,要排除有并发的其他疾病的群体,尤其是研究已报道的会改变肠道微生物的疾病。