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锐翌基因与浙江中医药大学在《Genome Biology》合作发表强直性脊柱炎研究成果
发布时间:2017-07-28 10:47   点击率:
2017年7月27日,锐翌基因与浙江中医药大学基础医学院温成平教授团队在《Genome Biology》上合作发表《Quantitative metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis》。重点研究了对强直性脊柱炎有标记性意义的肠道微生物群落。这是国内首例对该病与肠道微生物关联研究的详细报道。

 强直性脊柱炎,近在身边 
相信不少周杰伦的粉丝都知道,强直性脊柱炎困扰杰伦多年,强直性脊柱炎是风湿免疫科的常见病,根据最新的调查数据显示,我国有超过500万强直患者。该病的病因未完全明了,但与遗传有一定的相关性。原来,除了杰伦,他的叔叔也与他同病相怜。

 
“强直”经常被误诊为椎间盘突出或是运动扭伤,中青年男性往往羞于承认自己腰不好。80%的强直性脊柱炎患者首先表现为下腰背部间歇性痛感,这种晨僵有时可以持续数小时之久。有些病人还伴有髋、膝、踝关节肿痛,臀部、腹股沟疼痛,颈背部钝痛,足跟痛、低热、乏力等。如果出现腰背、下肢关节剧烈疼痛和晨起僵硬,还有脊柱活动受限,出现强直症状,则病情已经到了中期。如果不及时诊治,到了晚期,脊柱可能会连在一起,呈“竹节样”改变,像煮熟的虾一样弓起来,严重影响工作、生活甚至心理健康。有人说,强直性脊柱炎是一种“不死的癌症”。
 
 肠道菌群与强直性脊柱炎 
肠道菌群与宿主建立的共生关系影响着宿主代谢,生理和免疫的多方面,大量证据表明肠道菌群可能对强直性脊柱炎(AS)发挥了重要作用,该篇文章的报道,对微生物组在AS中的发病机制,评估预防和治疗AS的潜在肠道菌群靶向策略有着积极而又重要的意义。
 
 锐翌基因与浙江中医药大学强强联手 
文章通过97个AS病人和114个健康人开展定量宏基因组分析,深入研究了强直性脊柱炎(AS)与健康人在肠道菌群层面上的物种差异和基因差异,并通过功能分析探讨强直性脊柱炎的发病机制,并用验证组(AS组24人,健康组31人)对实验组(AS组73人,健康组83人)中找出的强直性脊柱炎的关键物种markers、基因markers和Clusters markers进行验证。锐翌基因作为主要贡献者之一,承担了宏基因组生物信息分析和亮点发掘工作,同时参与了大量文章撰写工作。

研究背景
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性疾病,严重危害人们的身心健康、生活质量等。目前AS在汉族中的发病率为0.2-0.54%,有8-10年的潜伏期,早期症状不易诊断。过去AS被认为是与遗传因素关系密切的疾病,与HLA-B27抗原有强关联性,而某些肠道微生物与易感者自身组织具有共同抗原,可引发异常免疫应答,这在AS的发病过程中也起到重要的作用。

中医理论认为,脾虚生痰湿痹阻经络关节是强直性脊柱炎(AS)的重要病因病机。肠道菌群功能与脾主运化的功能密切相关。临床上,AS患者常伴有腹泻等脾虚生湿的症状。现代医学也认识到,肠道菌群和脊柱关节病有密切联系,60%的AS患者伴有慢性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎和克隆恩病等。西医临床治疗AS的首选药物——柳氮磺吡啶的主要作用之一也在于调节肠道菌群。因此,肠道菌群失调与AS疾病发生存在着密切相关性。因此,浙江中医药大学温成平教授认为AS患者肠道内可能存在着严重的肠道菌群失调,并和锐翌基因一起开展了AS患者肠道宏基因组研究。

文章利用宏基因组测序技术研究AS患者与健康人的肠道菌群,旨在揭示肠道微生物在AS发病过程中可能的分子机制,以及通过肠道菌群进行AS疾病早期鉴别和早期发现潜在可利用的微生物标记物。

实验设计
收集97个AS病人的粪便进行宏基因组测序,下载114个已公开的健康人的宏基因数据用于分析比较(Qin. et al. Nature. 2014)。

实验组:AS病人组73人,健康人83人;
验证组:AS病人组24人,健康人31人;
测序策略:Illumina Hiseq 2000,PE100。
实验组选取73个AS病人,83个健康人,分析比较不同分类水平上健康人和AS病人的差异微生物;构建AS病人的基因集,与健康人进行基因比较,功能基因分析深度挖掘AS的疾病机制。基于微生物、基因和clusters选出AS的markers,使用验证组的24个AS病人和31个健康人进行判断,准确率高。

实验结果
1. AS患者肠道菌群失调
与健康组相比较,门水平,AS患者在放线菌门显著升高,梭杆菌门和疣微菌门显著降低,BF值(即厚壁菌门与拟杆菌门的比值)在AS患者和健康人之间没有显著差异;属水平,AS患者双歧杆菌属显著升高,肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属和克雷白杆菌属显著降低;种水平,AS患者普氏粪杆菌显著升高,拟杆菌和挑剔真杆菌显著降低。AS患者和健康人相比,某些肠道微生物存在显著差异,说明肠道微生物与AS疾病存在密切的联系。


图1 AS患者与健康人在不同分类水平上微生物差异比较
 
2. 差异基因和功能基因分析
AS病人与健康人中的微生物种类相比较,AS病人的Shannon-Wiener指数和Simspon多样性指数均低于健康人,AS的基因丰度也低(图2)。通过严格的筛选(基因平均丰度>1e-7,FDR<0.001,q<1e-4),找到23,709个基因在AS病人组和健康人组中存在显著差异(图3 a)。与LC(肝硬化)比较,AS的肠道微生物紊乱较小(图3 b)。

图2 AS病人中肠道微生物种类减少


图3 基因分布的P values

在功能分析中,结果显示AS病人中富集到Cell motility和Signal transdution功能代谢通路的基因数量明显低于健康人,而富集到Membrane transport和Metabolism of cofactors and vitamins代谢通路的基因数量显著高于健康人。

图4 AS和健康人的KEGG功能注释差异分析比较

在Module分析中,结果发现蛋白酶体(Proteasomes)相关的基因在AS病人的肠道菌群中显著富集,蛋白酶体只存在于真核生物、古生菌和放线菌门中,这与物种分析中发现AS病人的放线菌门显著升高的结果一致。

图5 AS相关的KEGG module分析

3. AS病人的MGS分析
AS中差异富集的6238个基因,聚成6个MGS(metagenomic species),健康人中差异富集的17471个基因,聚成23个MGS;验证组中6个MGS在AS组中显著富集,其中4个可以注释到菌株水平(图d),6个MGS在健康人中显著富集。将12个MGS与临床上判别AS的8个指标进行相关性分析,发现挑选的12个MGS有助于AS的判别(图B)。AS疾病与肝硬化、肥胖和T2D患者聚类的MGS对比,发现各种疾病的MGS具有特异性,可以依据不同的MGS区分不同的慢性病(图e)。

图6 AS的MGS分析

4. AS新的鉴定分类模型
使用3种方法挑选AS疾病的biomarkers,分别是33个物种markers、30个基因markers和62个clusters makers,构建AS疾病诊断的分类模型,在验证组中三种方法构建的AS分类模型的AUC分别为93.55%、96.64%和92.61%。
 

图7 AS疾病诊断的AUC曲线

研究结论
推测肠道菌群在AS炎症发生过程中可能的分子机制
1、AS患者中放线菌门数量显著升高,放线菌门可以调节上皮细胞的一些重要中介物的泛素化,比如IkB-a的泛素化,这个过程能激活 NF-kB代谢通路,促成炎症反应。
2、AS患者中拟杆菌属和肠杆菌属的数量显著降低,减少LPS的量,导致Regllly分泌不足,使AS病人肠道微生物紊乱。
图8 AS肠道微生物功能原理

 作者简介 
共同通讯作者兼第一作者:温成平
浙江中医药大学基础医学院副院长,教授,博士生导师。兼任国家中医药管理局中医痹病学(风湿病学)重点学科带头人、世界中医药学会风湿病专业委员会常务理事、中华中医药学会风湿病专业委员会常委、国家“十一五”“血液免疫病科中医临床研究”重大项目组组长。主持或完成了国家“十一五”支撑计划项目、国家公益性行业专项2项重大项目,以及国家自然基金、国家博士后基金、国家中医药管理局基金、省自然基金等省部级以上课题5项,参研国家级、省部级课题8项。发表学术论文40余篇,作为主要成员获国家科技进步二等奖、国家教学成果二等奖、省科学技术一等奖等省部级以上奖励5项。

共同第一作者:郑智俊
锐翌生物科技首席信息官,南开大学物理学专业毕业,2010年8月就职于深圳华大基因研究院,曾任华大基因研究院贯穿组学研究员,研究方向包括多组学分析和生物信息学。期间负责或参与了多个大研究项目。加入锐翌生物后,开展宏基因组学和人体肠道微生物组研究,2016年在Infect Dis Transl Med发表微生物组生物信息方法学综述文章,具有七年生物信息分析经验。2010年至今在Nature genetics、Genome Biology等国际顶尖期刊上发表了6篇学术论文。已发表文章累计影响因子91.21。

共同通讯作者:秦楠
锐翌生物科技CEO兼首席科学家,微生物组创新创业者协会联合创始人。国际人体微生物组协会(Internatioanl Human Microbiome Consortium)前秘书长,国际人体微生物组大会中国区总协调人。中华预防医学会微生态分会常务委员,青年委员会副主任委员,消化与营养组副组长。2016年亚洲冷泉港“微生物与环境”会议发起人之一,深圳市“国家级”领军人才,深圳市海外高层次人才(孔雀人才),2015年获得国家科技部和盖茨基金会评选的“大挑战·青年科学家”称号,同济大学附属第十人民医院兼职研究员,山东大学齐鲁医学部兼职研究员,美国弗吉尼亚理工大学微生物学博士。2008-2011年任华大基因(BGI)微生物基因组部门负责人,2011-2015年任浙江大学医学院感染性疾病诊治协同创新中心特聘研究员,博士生导师。目前研究领域包括感染性疾病、代谢类疾病、自身免疫性疾病与肠道菌群的关系,这些研究的长期目标是开发人类健康相关的肠道微生态诊断预防及干预新技术。2009年至今在Nature、Science、Nature Genetics、PNAS、PLOS Biology等国际顶尖学术期刊上发表论文30余篇。

共同通讯作者:Stanislav Dusko Ehrlich
教授,法国农业科学研究院微生物遗传研究所主任。欧盟人类肠道宏基因组学(MetaHIT)项目及第二期Metagenopolis计划首席科学家,曾师从于诺贝尔奖得主—细菌遗传学鼻祖Joshua Lederberg。在微生物方面的研究享誉世界,著作丰厚,已累计发表了论文300余篇,并参与编写了50多本著作。

合作方:Maxime Breban
法国Ambroise-Paré医院风湿病科主任医师,教授。目前已在Nat Genet、 Arthritis Rheum、Infect Immun、PLoS Genet等顶尖学术期刊上发表论文十余篇。Ambroise-Paré医院位于法国巴黎西部郊区的布洛涅-比扬古,是一所全球认可的欧洲教学医院。旗下拥有39家医院,每年接待约800万名病人住院或会诊。